周艷潔 謝丹尼

1.廣西壯族自治區(qū)南寧市人口和計劃生育服務(wù)中心(530022)；2.廣西壯族自治區(qū)人口和計劃生育研究中心

·綜 述·

地中海貧血防治進(jìn)展

周艷潔1謝丹尼2

1.廣西壯族自治區(qū)南寧市人口和計劃生育服務(wù)中心(530022)；2.廣西壯族自治區(qū)人口和計劃生育研究中心

地中海貧血(簡稱地貧)是世界上最常見、危害嚴(yán)重的單基因遺傳病[1]。地中海貧血是由于組成血紅蛋白的珠蛋白肽鏈合成障礙或速率降低，血紅蛋白產(chǎn)量減少所引起的一組遺傳性溶血性貧血。該疾病因首先在地中海沿岸國家發(fā)現(xiàn)，因此得名[2]。人類珠蛋白肽鏈有兩大類，即α-肽鏈與非α-肽鏈，非α肽鏈包括β、γ、δ、ε等，不同肽鏈構(gòu)成不同種類的血紅蛋白，由于珠蛋白基因突變的多樣性導(dǎo)致多種類型的地貧。臨床常見有α-地貧和β-地貧兩類型，分別是因α、β珠蛋白肽鏈合成障礙造成。地貧好發(fā)于地中海沿岸國家、美國黑人人群和印度次大陸等地，在我國南方發(fā)病率也很高。國內(nèi)地貧分布雖較廣，但以廣西、廣東及海南發(fā)病率高[3]，其中有報道廣西地貧基因攜帶率達(dá)20%～31.5%[4-5]?，F(xiàn)對常見類型的地貧防治進(jìn)展作一簡要綜述。

1 地貧的預(yù)防

地貧是人類近7000多種遺傳病中預(yù)防效果最好的幾種遺傳病之一，只要在妊娠前做好地貧檢測，診斷出地貧風(fēng)險夫婦(攜帶同類型地貧基因的夫婦)，指導(dǎo)風(fēng)險夫婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷、通過淘汰性流產(chǎn)就可以達(dá)到避免中、重型患兒出生的目的。孕前篩查、風(fēng)險夫婦的診斷及產(chǎn)前診斷的實施是能否完成這一預(yù)防工作的關(guān)鍵之所在。

1.1 地貧的篩查方法

主要篩查方法有以下幾種：① 紅細(xì)胞脆性定性試驗及紅細(xì)胞脆性一管定量法試驗：主要是檢測紅細(xì)胞脆性。②觀察紅細(xì)胞形態(tài)：制備新鮮血涂片，瑞氏染色，鏡檢紅細(xì)胞大小、異形性等形態(tài)改變。地中海貧血均以小細(xì)胞、低色素改變?yōu)橹?，異形性明顯，靶形紅細(xì)胞增多。③堿變性試驗：利用血紅蛋白(Hb)F抗堿能力比HbA強的原理，檢測HbF量，用于診斷重型β地貧。④HbH包涵體檢查：可檢出50%以上中間型α地貧(HbH病)，輕型α地貧偶見HbH包涵體。⑤醋酸纖維薄膜電泳法：采用pH8.6醋酸纖維薄膜不連續(xù)電泳法，查出HbH區(qū)帶或HbA2區(qū)帶過濃或過淺者。⑥Hb肽鏈分析：采用改良式聚丙烯酰胺凝膠電泳分析法(PAGE)檢測ζ鏈。以上6種方法人工操作程度高，工作量大,對技術(shù)人員業(yè)務(wù)素質(zhì)要求高,在大人群篩查中不適宜推廣。⑦紅細(xì)胞指數(shù)檢測：主要檢測平均紅細(xì)胞參數(shù)[紅細(xì)胞平均體積(MCV)、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)]，此方法為國際地貧協(xié)會推薦的方法，自動化程度高，結(jié)果受人為因素影響小,高效、準(zhǔn)確，是值得推廣的重要地貧篩查方法[6-7]。⑧全自動Hb電泳：Hb電泳是確診地貧的一種既可靠又快速的方法。主要是利用電泳依據(jù)Hb和異常Hb帶電不同加以分離,通過定量分析及異常區(qū)帶定位診斷地貧。萬志丹等[8]報道的電泳診斷地貧與基因比對具有良好的一致性。國內(nèi)有報道MCV、MCH、紅細(xì)胞(RBC)計數(shù)與Hb電泳篩查地貧準(zhǔn)確性達(dá)79%[9]。

1.2 地貧基因診斷

地貧篩查只是初步判斷是否攜帶地貧基因，但具體攜帶了某種類型地貧基因，只有做分子生物學(xué)分析即基因檢測才能準(zhǔn)確診斷。目前已知的α-地貧基因突變類型至少有81種,其中46種點突變,余下的35種為缺失型突變[10]。中國人中常見的缺失型α-地貧基因突變類型有3種，其中一種為α0突變，主要是東南亞缺失型(--SEA/αα)，最近廣西泰國缺失型(--THAI/αα)檢出率也較高達(dá)0.61%[11]。α+突變主要有兩種，即-α3.7/αα和-α4.2/αα。最近幾年廣西也發(fā)現(xiàn)少數(shù)香港型(HKαα), 香港型α-地貧是由-α3.7和α三聯(lián)體不平等交換重排結(jié)合而成的一種α-珠蛋白基因簇[12]。--SEA突變?nèi)笔Я艘粭l染色體上兩個α-珠蛋白基因, -α3.7/αα缺失了α2和α1兩個珠蛋白基因部分序列，剩下的序列首尾相連形成一個α2和α1-珠蛋白基因嵌合體，其序列與α1-珠蛋白基因相似。-α4.2/αα直接缺失α2-珠蛋白基因的全部序列，只留下α1序列。我國已知的α-地貧點突變類型主要有Hb Constant Spring(HbCS)、Hb Quong Sze(HbQS)和Hb Westmead(HbWS)3種，是因少數(shù)核苷酸的缺失、插入或置換造成。與α-地貧相比，β-地貧具有更多的突變型，β-地貧的分子病理具有高度異質(zhì)性，從而造成基因不表達(dá)或表達(dá)水平低，導(dǎo)致無功能mRNA產(chǎn)生及mRNA翻譯異常，或合成不穩(wěn)定的β-珠蛋白鏈。從β-地貧及相關(guān)疾病的患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200種β-珠蛋白基因突變[13]。對α、β-地貧分子病理的認(rèn)識，為其分子診斷奠定了基礎(chǔ)。

地貧基因檢測方法非常之多,先后經(jīng)歷了DNA點雜交、限制性內(nèi)切片段長度多態(tài)性(RFLP)鏈鎖分析、寡核苷酸(ASO)探針雜交、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體外基因擴增和芯片技術(shù)等[14]。自20世紀(jì)80年代來引入PCR這一項“革命”性的生物技術(shù)后，地貧診斷有了突破性進(jìn)展，因為不同引物、探針的設(shè)計以及基因擴增產(chǎn)物分析方法的不同又產(chǎn)生多種不同的地貧基因診斷方法。分別有：特異性PCR方法[15]、間隙PCR(gap PCR)技術(shù)[16-17]、突變基因特異性擴增系統(tǒng)法[18]、等位基因特異性擴增技術(shù)[19]、PCR結(jié)合特異寡核苷酸探針(PCR-ASO)斑點雜交法[20]、反向雜交(RDB)法[17、20]、突變寡聚核苷酸延伸擴增PCR(mutant oligonucleotide extension amplification,MOEA)技術(shù)[21]、多重等位基因特異PCR(multiplex allele specific PCR, MAS-PCR)法[22]、基因芯片法[23-24]等。目前國內(nèi)臨床上主要是應(yīng)用生物試劑公司生產(chǎn)的成熟、穩(wěn)定的試劑盒進(jìn)行地貧基因診斷，試劑盒綜合了以上各種方法的優(yōu)勢，結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好。成品試劑盒的應(yīng)用降低了對實驗室技術(shù)人員的要求，也大大節(jié)省了人力，使工作效率大幅度提高，使得地貧基因診斷技術(shù)易于推廣。

1.3 胎兒產(chǎn)前診斷

地貧篩查及分子診斷主要目的就是篩出攜帶同種類型地貧基因的夫婦(地貧風(fēng)險夫婦)，只有這類夫婦才有可能且每次妊娠都有1/4幾率懷上中、重型地貧兒。這類夫婦在妊娠后胎兒需做產(chǎn)前診斷，通過淘汰性流產(chǎn)避免中、重型地貧兒出生。目前胎兒產(chǎn)前診斷主要有胎兒基因診斷和超聲檢查。

超聲檢查對重型α-地貧胎兒(即Bart’s水腫兒)篩查效果較好，因為重型α-地貧胎兒因嚴(yán)重貧血導(dǎo)致不同程度全身皮膚及皮下組織增厚水腫、胸腔積液、心包積液、腹水、心臟增大、心室壁增厚、肝脾腫大以及胎兒發(fā)育明顯小于正常妊娠月份胎兒，這些體征在孕中期產(chǎn)前超聲均能較好探測到。李秋明等[25]對超聲篩查出的102例水腫兒經(jīng)基因檢測有100例確診為重型α-地貧胎兒，2例為其它原因水腫。武艷琳等[26]對12例經(jīng)基因診斷的重型α-地貧胎兒在孕中期B超篩出11例,漏診1例。B超檢查無創(chuàng)傷性，穩(wěn)定、重復(fù)性好，方便快捷易被檢查對象所接受。但最后確診必須依賴基因檢測，且超聲檢查無法篩查出重型β-地貧胎兒和中間型地貧胎兒。

地貧產(chǎn)前診斷主要就是依靠胎兒基因檢測，胎兒基因檢測最關(guān)鍵的核心技術(shù)是如何獲取胎兒遺傳物質(zhì)。目前臨床上常用的是侵入性(有創(chuàng)性)的3種取材方法，一是在妊娠8周左右取絨毛，二是在妊娠16～20周抽取羊水，三是在妊娠中晚期抽取胎兒臍血。這些取材方法對產(chǎn)科醫(yī)生的操作技術(shù)要求相當(dāng)高，尤其是取絨毛和胎兒臍血要求取材醫(yī)生操作技術(shù)相當(dāng)嫻熟，且取胎兒臍帶血還容易被母血污染[27]。目前，全國范圍內(nèi)地貧產(chǎn)前診斷都是采用以上3種侵入性取材方法獲取標(biāo)本來提取胎兒遺傳物質(zhì)進(jìn)行基因檢測，以抽羊水方法最多見。與取絨毛和臍帶血相比，抽羊水的操作技術(shù)容易掌握、易推廣。20世紀(jì)中期有研究人員從孕婦外周血游離出胎兒細(xì)胞，為無創(chuàng)性地貧產(chǎn)前診斷技術(shù)找到突破點。1997年Lo等[28]利用聚合酶鏈反應(yīng)首次成功從孕婦外周血擴增到胎兒細(xì)胞。Lo等[29]1998年通過研究證實孕婦外周血中胎兒游離DNA的代謝動力學(xué)特征有別于有核紅細(xì)胞DNA。龍興江等[30]對37例孕婦血漿中胎兒游離DNA標(biāo)本進(jìn)行β-地貧檢測，準(zhǔn)確率達(dá)91.9%，與有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷方法比較有3例誤診。

2 地貧治療

目前對地貧尚無理想的根治方法，給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和精神傷害[31]?，F(xiàn)臨床上主要以輸血、除鐵等對癥處理為主，造血干細(xì)胞移植、基因治療等根治方法有待進(jìn)一步研究。

2.1 輸血、除鐵

對于重型地貧患者，因血紅蛋白合成嚴(yán)重不足，為維持正常的生長發(fā)育，目前最主要、最常規(guī)的手段就是長期規(guī)律的輸血維持生命[32]。因長期反復(fù)輸血及骨髓紅系細(xì)胞造血過盛等造成體內(nèi)鐵負(fù)荷過重，過多的鐵沉積于心、肝、腦等器官，導(dǎo)致重要器官損傷甚至衰竭[33]，英國曾有報道50%重型β-地貧患者在35歲前死亡主要是因為心臟病變[34]。因此，對長期輸血的地貧患者除鐵治療至關(guān)重要，主要應(yīng)用鐵螯合劑，目前常用的鐵螯合劑為去鐵胺。用除鐵劑前應(yīng)常規(guī)對體內(nèi)鐵負(fù)荷進(jìn)行評估，防止過早使用除鐵劑影響小兒骨骼生長。

2.2 造血干細(xì)胞移植

異基因骨髓移植、外周血干細(xì)胞移植及臍血移植是目前根治重型地貧的方法，通過糾正珠蛋白鏈合成異常的遺傳缺陷而根治地貧[35]。Issaragrisil等[36]1995年進(jìn)行了13例臍帶血移植治療地貧。Yesilipek等[37]報道15例異基因外周血干細(xì)胞移植治療β-地貧。移植效果與患者年齡、身體狀況、預(yù)處理方案、供者來源、人類白細(xì)胞抗原(HLA)相合程度及對并發(fā)癥的處理等因素相關(guān)。因配型相合的骨髓源非常難找，且短時間內(nèi)高昂的治療費及移植后排異反應(yīng)等等因素使得此方法目前在臨床上還難以推廣。

2.3 藥物治療

通過藥物刺激或重新激活珠蛋白基因的表達(dá)，增加血紅蛋白的合成，如羥基脲、組蛋白去乙?；敢种苿┖腿ゼ谆瘎┑龋@些藥物對某些β-地貧患者有一定療效[38]。有研究報道根據(jù)中醫(yī)辯證研制出的中成藥—益髓生血顆粒對β-地貧有一定療效[39]。

2.4 脾切除及脾動脈栓塞

對巨脾或脾功能亢進(jìn)者可行脾切除術(shù)或脾動脈栓塞術(shù)以減輕溶血，對中間型地貧患者治療效果較好。但脾切后免疫功能降低易合并感染。

2.5 基因治療

將地貧患者的造血干細(xì)胞取出，在體外導(dǎo)入并整合正常的珠蛋白基因后再植入患者體內(nèi)，使轉(zhuǎn)移的珠蛋白基因隨干細(xì)胞分化獲得紅細(xì)胞特異的高水平表達(dá)，達(dá)到治療地貧目的。Cavazzana-Calvo等[40]2010年成功對1例18歲的重型β-地貧患者實施治療?；蛑委熓菍淼刎氈委煹难芯糠较?，但基因組的同源重組以慢病毒作載體導(dǎo)入患者體內(nèi)，其安全性有待進(jìn)一步研究、考證。

3 總結(jié)及展望

重型地貧患者目前總體預(yù)后很差[1]，多數(shù)于學(xué)齡前因嚴(yán)重貧血、繼發(fā)感染、心力衰竭而死亡。因此，預(yù)防顯得尤為重要。國內(nèi)、外研究表明，積極開展地貧基因攜帶者的人群篩查，指導(dǎo)婚配及產(chǎn)前診斷，預(yù)防中、重型地貧患兒的出生，是控制地貧發(fā)病率的主要方法[41]。70年代中期以來，意大利、希臘、塞浦路斯、西西里、撒丁島、新加坡以及我國的香港、臺灣等地貧高發(fā)區(qū)，實施了世界衛(wèi)生組織提出的遺傳病社區(qū)防治規(guī)劃，建立了高層次研究中心和基層聯(lián)系網(wǎng)點，開展地貧的社會教育，群體篩查，遺傳咨詢，產(chǎn)前診斷等系列服務(wù)，使這些地區(qū)重型地貧的發(fā)生率大大降低，有的地區(qū)的發(fā)病率已降至“零”水平[42]。此類遺傳病逐年得到控制和減少，提高人口素質(zhì)，其間接創(chuàng)造的經(jīng)濟效益也將是巨大的[43]。根據(jù)本地區(qū)實際情況，要做好地貧預(yù)防工作，須解決以下三大核心問題。

3.1 人群的宣傳教育

在地貧高發(fā)區(qū)，地貧干預(yù)需要每對待育夫婦參與?？墒菑V大農(nóng)村人群文化素質(zhì)普遍較低，且外出打工，人員流動性大，導(dǎo)致主動參與意識不夠。因此，需充分利用新聞媒介和民政、衛(wèi)生計生等宣傳陣地，以電視、報紙、宣傳板報、講座等形式大力宣傳和普及地貧基本知識，讓全社會都知道地貧的危害性及地貧干預(yù)知識[44]。同時，在育齡人群接受檢查時，大力強化宣傳地貧的危害及高發(fā)區(qū)發(fā)病現(xiàn)狀。達(dá)到讓對象主動關(guān)注自己的檢查結(jié)果，主動回來找醫(yī)生咨詢的目的。在大人群干預(yù)工作中，人群健康教育的投入是否到位是工作的基礎(chǔ)。

3.2 成熟的技術(shù)路線

我國對地貧這一遺傳病的防治非常重視，對高發(fā)區(qū)投入了大量干預(yù)經(jīng)費。廣西計劃生育技術(shù)服務(wù)網(wǎng)絡(luò)自2000年開始就針對新婚夫婦地貧預(yù)防開展了人群健康教育、地貧篩查、基因檢測及高風(fēng)險夫婦的重點跟蹤、指導(dǎo)等基礎(chǔ)性工作，營造了一個有利于工作開展的社會氛圍，基本建立起省、市、縣三級計劃生育技術(shù)干預(yù)網(wǎng)絡(luò)，為地貧干預(yù)打下了堅實的基礎(chǔ)[45-46]。醫(yī)療機構(gòu)中,廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、廣西婦幼保健院等建立了省級地貧產(chǎn)前診斷中心，市級婦幼保健院建立了地貧產(chǎn)前診斷分中心，縣級婦幼保健院建立了地貧篩查實驗室。實驗室設(shè)備及人員配置也相應(yīng)到位，基本搭建起地貧大人群干預(yù)框架。在此基礎(chǔ)上，穩(wěn)定、成熟的實驗室技術(shù)路線是工作能否真正做到位的關(guān)鍵。地貧篩查及地貧基因診斷方法之繁多如上所述，必須從眾多的檢測方法中探索出適合在基層開展初篩，穩(wěn)定、易質(zhì)控、高效的實驗方法[47]。充分細(xì)化明確網(wǎng)絡(luò)內(nèi)各層面實驗室的任務(wù)及標(biāo)本的規(guī)范處理、轉(zhuǎn)診、交接等等工作職責(zé)。統(tǒng)一做好網(wǎng)絡(luò)內(nèi)各實驗室的質(zhì)量控制，規(guī)范檢測常規(guī)及各種制度。讓對象抽一次血就能通過標(biāo)本轉(zhuǎn)診，最后診斷出所有風(fēng)險夫婦。因為地貧初篩需每對待育夫婦參加，涉及大量人群，只有高效、準(zhǔn)確篩出重點人群(即地貧風(fēng)險夫婦)。才能在有限的人力、物力情況下跟蹤、指導(dǎo)重點人群做好后續(xù)工作。

3.3 產(chǎn)前診斷無創(chuàng)性取材技術(shù)的推廣

目前在臨床上地貧產(chǎn)前診斷取材的3種方法都是創(chuàng)傷性的，不僅對取材醫(yī)生操作技術(shù)提出較高要求，也給孕婦和胎兒帶來損傷風(fēng)險[48]。相當(dāng)部分地貧風(fēng)險夫婦難以接受這樣的取材方法，很大程度上阻礙了地貧干預(yù)工作進(jìn)展。因此，無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)—從孕婦血液中直接分離提取胎兒遺傳物質(zhì)，是今后研究方向，這一技術(shù)對實驗室人員綜合素質(zhì)及實驗室硬件提出較高要求[49]。如果無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)在臨床上得到普及、推廣，地貧防治工作將會有實質(zhì)性突破。隨著地貧檢測技術(shù)不斷成熟，無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)應(yīng)有較好的發(fā)展前景。

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[責(zé)任編輯：王麗娜]

廣西壯族自治區(qū)人口和計劃生育委員會科研課題(桂人口計生研1108)

2015-02-25