周丹娜，夏菲，段正贏，劉學(xué)，郭銳，楊克禮，袁芳艷，劉澤文，孟麗，蔡行，田永祥

摘要：日本乙型腦炎（JE）是由乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的蚊媒性人畜共患病，造成人畜中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，威脅人畜健康。JEV的非結(jié)構(gòu)蛋白1（Nonstructural protein 1，NS1）是其重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，一方面可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫，另一方面參與病毒復(fù)制等多種生物學(xué)過(guò)程。試驗(yàn)采用化學(xué)融合法獲得分泌乙型腦炎NS1蛋白單克隆抗體（McAb）的雜交瘤細(xì)胞系5D5，經(jīng)檢測(cè)獲得的雜交瘤細(xì)胞系平均染色體數(shù)目約為90條，分泌的單抗為IgG1亞型，細(xì)胞上清效價(jià)為27。接種小鼠后，收取腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化后，測(cè)得腹水效價(jià)為105。Western blot鑒定結(jié)果表明所制備單抗能夠與JEV NS1蛋白特異性結(jié)合，具有良好的免疫反應(yīng)性，可為JE診斷方法的建立以及NS1蛋白生物學(xué)功能的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：日本乙型腦炎;非結(jié)構(gòu)蛋白1;單克隆抗體

中圖分類號(hào)：S852.65 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）23-5809-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.047

日本乙型腦炎（JE）是由乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的蚊媒性人畜共患病，造成人畜中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，威脅人畜健康。JEV的非結(jié)構(gòu)蛋白1（Nonstructural protein 1，NS1）是其重要的非結(jié)構(gòu)蛋白，一方面可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫，另一方面參與病毒復(fù)制等多種生物學(xué)過(guò)程。試驗(yàn)采用化學(xué)融合法獲得分泌乙型腦炎NS1蛋白單克隆抗體（McAb）的雜交瘤細(xì)胞系5D5，經(jīng)檢測(cè)獲得的雜交瘤細(xì)胞系平均染色體數(shù)目約為90條，分泌的單抗為IgG1亞型，細(xì)胞上清效價(jià)為27。接種小鼠后，收取腹水，經(jīng)辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化后，測(cè)得腹水效價(jià)為105。Western blot鑒定結(jié)果表明所制備單抗能夠與JEV NS1蛋白特異性結(jié)合，具有良好的免疫反應(yīng)性，可為JE診斷方法的建立以及NS1蛋白生物學(xué)功能的研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

日本乙型腦炎病毒是目前世界流行性病毒性腦炎的最常見病原，年均感染約50 000人，其中約30%死亡[1]。乙型腦炎病毒基因組全長(zhǎng)10 976 bp，分子質(zhì)量在3 000 kD左右，單股正鏈RNA。JEV基因組由非編碼區(qū)和單一開放讀架（ORF）組成。ORF是含有10 296個(gè)堿基的中間片段，共編碼10種蛋白，分別是核心蛋白、膜蛋白和囊膜蛋白這3種結(jié)構(gòu)蛋白和NS1蛋白、NS2a蛋白、NS2b蛋白、NS3蛋白、NS4a蛋白、NS4b蛋白、NS5蛋白這7種非結(jié)構(gòu)蛋白。NS1蛋白由415個(gè)氨基酸組成，胞外分泌，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量為40 kD左右。與其他非結(jié)構(gòu)蛋白不同，NS1蛋白可以通過(guò)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞融合作用殺死感染細(xì)胞，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生非中和性的保護(hù)力，即在沒有中和抗體的情況下就能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的保護(hù)力，并且沒有抗體依賴性增強(qiáng)（ADE）作用[2]。此外，由于不同血清型或基因型的乙型腦炎毒株間NS1的基因和表型同源性很高，所以，可被用來(lái)做RT-PCR檢測(cè)和研制具有廣泛作用的亞單位疫苗[3]。除免疫保護(hù)性外，Mason等[4]通過(guò)E.coli將JEV抗原進(jìn)行表達(dá)后證實(shí)了NS1蛋白在被JEV感染的細(xì)胞中有兩種存在形式，分別是NS1和NS1′，它們含有同樣的N末端，但是NS1′的C末端有一段由NS2a基因編碼的高度疏水的氨基酸序列。NS1′的合成可能依賴于其二級(jí)結(jié)構(gòu)，NS1′蛋白被證實(shí)是細(xì)胞凋亡過(guò)程中半胱天冬酶底物[5]。Lee等[6]認(rèn)為NS1作為一種糖蛋白，在病毒復(fù)制的前期發(fā)揮作用，且可能與膜功能相關(guān)。因此，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，擬以日本乙型腦炎病毒NS1為靶蛋白，制備單克隆抗體，不僅可以為深入研究NS1蛋白生物學(xué)功能提供研究工具，也為乙型腦炎病毒抗體/抗原檢測(cè)方法的研發(fā)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)條件。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

日本乙型腦炎病毒HW1株、SP2/0均由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保存;NS1-pET-28（a）質(zhì)粒、NS1重組蛋白由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所構(gòu)建及表達(dá)[7]。BALB/c小鼠購(gòu)自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;JEV參考血清、TMD顯色液和終止液購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT干粉、HT干粉、8-氮鳥嘌呤、融合劑50%PEG4000、羊抗豬IgG-HRP、HPR-標(biāo)記羊抗小鼠IgG、小牛血清白蛋白組分V（BSA）、秋水仙素購(gòu)自Sigma公司;RPMI-1640、胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司;二甲基亞砜（DMSO）、青、鏈霉素混合液（100×）（Gibco）、液體石蠟等購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;快速ELISA小鼠單克隆抗體分型試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific Pierce公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?NS1-iELISA試驗(yàn) ?將重組表達(dá)的NS1重組蛋白純化后溶于pH9.6的碳酸鹽緩沖液中，從1∶20～1∶640做倍比稀釋包被ELISA板，參考陰、陽(yáng)性血清從1∶20～1∶160作倍比稀釋進(jìn)行方陣試驗(yàn)，選擇最佳包被濃度和血清稀釋倍數(shù)，初步建立iELISA抗體檢測(cè)法。

操作步驟：將每孔100 μL包被液倍比稀釋的 NS1蛋白包被酶標(biāo)板，置于4 ℃過(guò)夜，甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，用確定好的封閉液37 ℃封閉1 h，甩掉板孔中的溶液。酶標(biāo)板用時(shí)，每孔加入100 μL稀釋后的待檢樣品，輕輕振勻孔中樣品，置37 ℃溫育30 min。甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，200 μL/孔，每次靜置3 min倒掉，最后一次拍干。每孔加酶標(biāo)二抗100 μL，輕輕搖勻置37 ℃溫育30 min。甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板5次，200 μL/孔，每次靜置3 min倒掉，最后一次拍干。每孔加底物液，室溫避光顯色10 min，加終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm下的OD值。

挑選16份日本乙型腦炎抗體檢測(cè)呈陰性的豬血清，按照上一步確定的試驗(yàn)條件進(jìn)行ELISA，計(jì)算平均值（x），標(biāo)準(zhǔn)差（SD）;陰陽(yáng)性臨界值即為x+3SD。

1.2.2 ?單克隆抗體的制備及亞型鑒定 ?將NS1蛋白用PBS緩沖液稀釋到400 μg/mL，與弗氏完全佐劑等體積充分混勻乳化，選擇雌性4周齡BALB/c小鼠4只，腹腔注射0.2 mL/只，同時(shí)頸背部皮下多點(diǎn)注射0.2 mL/只。并于首免后第2周、第3周同劑量加強(qiáng)免疫。3免過(guò)后第7天斷尾采血，用ELISA法檢測(cè)抗體水平，選擇免疫血清效價(jià)最高的BALB/c小鼠用NS1蛋白0.4 mL脾內(nèi)沖擊免疫一次，3 d后進(jìn)行融合。取免疫小鼠脾細(xì)胞，并用50%聚乙二醇將其與SP2/0融合，通過(guò)上述建立的ELISA方法篩選雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，將陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞按極限稀釋法進(jìn)行克隆。

采用亞型鑒定試劑盒，依據(jù)手冊(cè)指示來(lái)鑒定單克隆抗體的亞型。

1.2.3 ?雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù) ?將雜交瘤細(xì)胞傳代后36～48 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加秋水仙素，使其終濃度為0.04 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)5 h;1 000 r/min離心10min，收集細(xì)胞;加入已37 ℃預(yù)溫的0.075 mol/L的KCl低滲溶液5 mL，吹打細(xì)胞使其懸浮混勻，置于37 ℃水浴15～20 min;加入固定液1 mL，1 000 r/min離心10 min，棄上清液;加固定液5 mL，輕輕混勻，靜置30 min，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，重復(fù)2次;加固定液5 mL，混勻，封管口，4 ℃過(guò)夜;1 000 r/min離心10 min，棄上清液，留下0.5 mL上清液，混勻，用滴管吸取細(xì)胞懸液自10～20 cm高處滴在4 ℃預(yù)冷的載玻片上，立即吹散，使細(xì)胞平鋪其上，自然干燥;10% Giemsa染色10 min，用自來(lái)水洗去染液，自然干燥;選擇染色體分散好、無(wú)重疊、無(wú)失散的細(xì)胞進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。每10個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。

1.2.4 ?腹水的制備與純化 ?選8周齡的BALB/c小鼠，滅菌液體石蠟腹腔注射0.5 mL/只;7 d后，將穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞按5.0×106個(gè)/只腹腔接種小鼠;10 d后抽取小鼠腹水，1 500 r/min離心10 min，收取上清液。采用辛酸-硫酸銨沉淀法對(duì)腹水上清進(jìn)行純化，去除雜蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)純化效果，并用上述建立的ELISA方法檢測(cè)純化后腹水的效價(jià)。

1.2.5 ?NS1單抗的免疫印跡分析 ?收集被感染的日本乙型腦炎病毒細(xì)胞，通過(guò)SDS-PAGE分離，然后以350 mA電流作用1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，再用含有1% BSA和5%脫脂奶粉的TBST緩沖液（0.01 mol/L pH 8.0 Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20）封閉膜過(guò)夜，隨后加入1∶500稀釋的單抗37 ℃孵育1 h，用TBST緩沖液洗滌3次后，膜中加入1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗于37 ℃孵育1 h。依次用TBST緩沖液洗滌3次，TBS洗滌2次后，通過(guò)DAB顯現(xiàn)蛋白帶。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?NS1-iELISA包被濃度、血清稀釋倍數(shù)選擇及臨界值的判定

以純化后的NS1重組蛋白（0.68 mg/mL）倍比稀釋包被ELISA板，進(jìn)行方陣滴定檢測(cè)日本乙型腦炎病毒參考陰、陽(yáng)性血清。方陣試驗(yàn)結(jié)果如表1、表2所示。由表1、表2可知，當(dāng)抗原NS1蛋白40倍稀釋，血清也以40倍稀釋時(shí)，陽(yáng)性血清OD630 nm值為1.085，陰性血清OD630 nm值為0.148，陽(yáng)性值與陰性值差異較大，比值較高。因此，選定NS1蛋白最佳包被濃度為17 μg/mL，血清以40倍稀釋。

根據(jù)16份JEV抗體陰性臨床血清檢測(cè)結(jié)果的OD630 nm，計(jì)算其平均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）、臨界值（x+3SD），結(jié)果如表3所示。其臨界值判定為0.317。

2.2 ?單克隆抗體制備及亞型鑒定

對(duì)小鼠免疫3次后第7天進(jìn)行斷尾采血，用上述NS1-iELISA方法進(jìn)行血清效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果小鼠效價(jià)達(dá)到1∶6 400，加強(qiáng)免疫3 d后可進(jìn)行融合。經(jīng)過(guò)3次極限稀釋法篩選獲得一株雜交瘤細(xì)胞系5D5。將5D5的單抗細(xì)胞上清按2n進(jìn)行稀釋，經(jīng)NS1- iELISA檢測(cè)，單抗細(xì)胞上清效價(jià)為27，同時(shí)，設(shè)立pET-28（a）/BL21菌破碎上清液為包被物的ELISA試驗(yàn)作對(duì)照，結(jié)果顯示單抗與BL21菌體蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。用單抗亞型鑒定試劑盒檢測(cè)制備的單抗，結(jié)果顯示，此單抗的亞型為IgG1。

2.3 ?雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)

利用吉姆薩氏染色法對(duì)雜交瘤細(xì)胞的染色體進(jìn)行染色，染色體形態(tài)如圖1所示。計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，染色體數(shù)平均值為90條/細(xì)胞。

2.4 ?腹水的制備與純化

收集的腹水采用辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行初步純化，純化前后均留樣進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，純化后的單抗分別在50 kD左右和25 kD左右有明顯的重鏈條帶和輕鏈條帶，大小正確。將純化后的腹水用NS1-iELISA方法檢測(cè)，效價(jià)為105。

2.5 ?Western blot鑒定分析

免疫印跡分析試驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，NS1單抗5D5可與JEV蛋白產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)，且有兩條反應(yīng)條帶。

3 ?小結(jié)與討論

在本研究中，純化的重組表達(dá)NS1蛋白用來(lái)接種免疫小鼠生產(chǎn)單抗。通過(guò)ELISA試驗(yàn)篩選雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液，生成NS1蛋白單克隆抗體1株。通過(guò)免疫印跡分析試驗(yàn)證實(shí)所獲單克隆抗體具有較高的特異性。

本研究免疫小鼠的抗原是采用原核表達(dá)的NS1蛋白經(jīng)鎳柱純化與弗氏佐劑混合乳化后所得，免疫小鼠后，會(huì)同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)NS1蛋白、HIS標(biāo)簽蛋白或殘留的BL21菌體蛋白的抗體，可能會(huì)對(duì)篩選造成干擾。因此，本研究在篩選單抗時(shí)，有設(shè)立將pET-28（a）/BL21破碎后的蛋白溶液包被作對(duì)照，以保證所篩選出單抗的特異性。

大量生產(chǎn)單抗主要有細(xì)胞培養(yǎng)法和小鼠腹水法。小鼠腹水法雖然有可能會(huì)受到鼠源性雜質(zhì)的干擾，但其具有腹水生產(chǎn)速度快（一般只需7～10 d）且產(chǎn)量高、腹水較易純化等優(yōu)點(diǎn)，因此，本試驗(yàn)大量生產(chǎn)單抗采用腹水法。本試驗(yàn)采用弗氏不完全佐劑腹腔注射致敏小鼠，1周后，再腹腔注射所篩選出雜交瘤細(xì)胞。因?yàn)樽⑸浼?xì)胞量太少會(huì)導(dǎo)致腹水生產(chǎn)時(shí)間太長(zhǎng)，而細(xì)胞量太多則可能形成實(shí)體瘤。本研究細(xì)胞注射量為5.0×106個(gè)/只，注射過(guò)程中注意緩慢推入。本試驗(yàn)在收集腹水時(shí)，未見小鼠形成實(shí)體瘤，均有收集到腹水。

陳丹等[8]分別采用辛酸法、硫酸銨法與辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體，對(duì)這3種方法純化抗體的效果進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示單獨(dú)采用辛酸法或硫酸銨法純化效果較差，而辛酸-硫酸銨沉淀法純化效果較好。本試驗(yàn)所收集小鼠腹水采用辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行初步分離純化，該方法成本低廉，操作較為簡(jiǎn)單，且初步純化效果較好。經(jīng)此方法純化后，已除去單克隆抗體中的大部分雜蛋白。

綜上所述，本研究制備了抗NS1單克隆抗體并定性。該單克隆抗體可以作為研究日本乙型腦炎免疫機(jī)理、病毒復(fù)制機(jī)制的有效工具，并為進(jìn)一步研究日本乙型腦炎病毒的發(fā)病機(jī)制打下了基礎(chǔ)。

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