王亞南,陳昭華,陳衛(wèi)昌

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 215006,2.蘇州市立醫(yī)院本部/南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院本部檢驗(yàn)科 215002)

microRNA-141在結(jié)腸癌中的表達(dá)分析研究*

王亞南1,2,陳昭華2,陳衛(wèi)昌1△

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科 215006,2.蘇州市立醫(yī)院本部/南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院本部檢驗(yàn)科 215002)

目的分析microRNA141(miR-141)在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及意義?方法 采用熒光定量PCR(SYBR Green)法檢測(cè)48例結(jié)腸癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中miR-141的表達(dá)?結(jié)果miR-141在結(jié)腸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為5.19±0.52,與對(duì)應(yīng)癌旁正常組織1.01±0.13比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);隨著結(jié)腸癌分化程度的降低結(jié)腸癌組織中miR-141的表達(dá)增高;miR-141在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的相對(duì)表達(dá)量為6.05±0.14,在淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移組中為4.30±0.23,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?結(jié)論miR-141高表達(dá)可能與結(jié)腸癌的分化程度和淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移有關(guān)?miR-141的出現(xiàn)為結(jié)腸癌的研究提供了新的切入點(diǎn)?

結(jié)腸腫瘤;微小RNA-141;實(shí)時(shí)PCR

microRNA(miR)是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA分子,通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)?結(jié)腸癌的形成是一個(gè)多基因?多階段?長(zhǎng)期復(fù)雜的過(guò)程?至今,在人類(lèi)基因組中已發(fā)現(xiàn)1 000多個(gè)miR[1],它們廣泛參與器官發(fā)育?腫瘤發(fā)生?細(xì)胞增殖分化以及細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程[2-3]?miR-141是 miR-200家族中的一員,是一種具有上皮組織細(xì)胞特異性的微小RNA[4]?本文采用實(shí)時(shí)定量(real-time)PCR技術(shù)檢測(cè) miR-141在結(jié)腸癌組織和相對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)情況,分析其與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,探索miR-141在結(jié)腸癌中的表達(dá),為研究miR-141在結(jié)腸癌中的作用提供前期科學(xué)數(shù)據(jù)?

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集蘇州市立醫(yī)院本部2011年6月至2012年10月48例住院的結(jié)腸癌患者,其中男22例,女26例,平均年齡61.2歲,均未經(jīng)任何手術(shù)治療以及放?化療,均經(jīng)病理確診?本研究經(jīng)過(guò)院倫理委員會(huì)同意并簽署患者知情同意書(shū)?取組織標(biāo)本離體后10min內(nèi)置于液氮罐內(nèi)迅速冷凍后置-80℃保存?

1.2 主要試劑與儀器 Trizol總RNA提取試劑購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司,miR-cute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒?miR-cute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司?LifePro普通PCR儀(博日科技),PCR System7500擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司),Eppendof高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendof公司),超低溫冰箱?生物安全柜(上海瑞仰)?

1.3 實(shí)時(shí)定量PCR(real time PCR)反應(yīng) 正向引物由天根生化科技(北京)有限公司設(shè)計(jì)合成(引物序列暫不提供),miR-141上游引物目錄號(hào)為CD201-0216,內(nèi)參miR-16的上游引物目錄號(hào)為CD201-0235?反向引物為天根miR-cute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒配套提供?組織總RNA提取,合成的cDNA于-20℃冰箱保存?PCR反應(yīng)體系為20μL:2×miR-cute miRNA Premix(含SYBR,含 ROX)10.0μL,正向引物(10μmol/L)0.4μL,反向引物(10μmol/L)0.4μL,miRNA第一鏈cDNA 2.0μL,50×ROX Reference Dye 1.6μL,ddH2O 5.6μL?擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性2min;94℃20s,60℃34s,43個(gè)循環(huán)?

1.4 結(jié)果計(jì)算 所有反應(yīng)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔,記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值),以miR-16作為內(nèi)參照,對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行歸一化處理,以確保相等數(shù)量的樣品中比較目標(biāo)基因的量?采用定量PCR中的相對(duì)定量法,表達(dá)量倍數(shù)的變化用 F=2-△△Ct法計(jì)算?△△Ct=(CtmiR-141-CtmiR-16)結(jié)腸癌組織-(CtmiR-141-CtmiR-16)癌旁組織?

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)法作數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn),符合正態(tài)性分布計(jì)量資料采用±s表示,比較采用成組設(shè)計(jì)的兩樣本t檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析?以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)腸癌組織中miR-141和miR-16PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果擴(kuò)增片段經(jīng)3%瓊脂糖電泳,可見(jiàn)明亮?清晰?電泳條帶,且與理論大小一致(miR-141擴(kuò)增片段79bp,miR-16擴(kuò)增片段79 bp),見(jiàn)圖1?

圖1 結(jié)腸癌組織miR-141和miR-16PCR產(chǎn)物電泳圖

* 基金項(xiàng)目:南京醫(yī)科大學(xué)校基金項(xiàng)目(2011NJMU166)?作者簡(jiǎn)介:王亞南(1980-),主管檢驗(yàn)師,博士在讀,主要從事結(jié)腸癌研究?△通訊作者,Tel:13962101298;E-mail:weichangchen@126.com?

2.2 miR-141在結(jié)腸癌組組織和相對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá) 以 miR-16為內(nèi)參,用real-time PCR(SYBR Green)檢測(cè)miR-141在結(jié)腸癌組和相對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)?結(jié)果顯示miR-141在結(jié)腸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為5.19±0.52,與癌旁正常組織中 miR-141的表達(dá)量(1.01±0.13)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)?見(jiàn)圖2?

圖2 miR-141在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

2.3 結(jié)腸癌組織miR-141表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)腸癌組織miR-141在不同的年齡組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);結(jié)腸癌組織miR-141在男性和女性中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);結(jié)腸癌組織miR-141在結(jié)腸癌腫塊直徑小于或等于5cm和腫塊直徑大于5cm組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);結(jié)腸癌組織 miR-141在高分化?中分化?低分化肺癌組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為3.36±0.18?4.98±0.22?5.32±0.25,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),隨著分化程度的降低結(jié)腸癌組織miR-141的表達(dá)增高;結(jié)腸癌組織miR-141在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組的相對(duì)表達(dá)量為6.05±0.14,在淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移組中為4.30±0.23,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),見(jiàn)表1?

表1 結(jié)腸癌組織miR-141表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(±s)

表1 結(jié)腸癌組織miR-141表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(±s)

項(xiàng)目 n miR-141的表達(dá)P年齡(歲)0.4240 10 5.16±0.15 40～60 20 5.24±0.16>60 18 5.18±0.22性別0.31男22 5.16±0.19女26 5.22±0.22腫塊直徑(cm)0.39≤5 32 5.22±0.24>5 16 5.45±0.19分化程度0.01高分化 13 3.36±0.18中分化 20 4.98±0.22低分化 15 5.32±0.25淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.02有28 6.05±0.14無(wú)20 4.39±0.23

3 討 論

結(jié)腸癌是臨床上常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,是結(jié)腸黏膜上皮在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡性病變,其發(fā)生發(fā)展是多基因?多步驟作用的結(jié)果?miR是一類(lèi)非編碼小RNA分子,成熟的miR一般有19～25個(gè)堿基,通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)[5]?成熟的 miR能夠識(shí)別特定的 mRNA,通過(guò)與靶基因mRNA 3′-UTR完全或不完全配對(duì)來(lái)促進(jìn)目標(biāo)mRNA的降解或抑制目標(biāo)mRNA的翻譯過(guò)程而發(fā)揮負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的作用[6]?miR的異常表達(dá)或基因突變將對(duì)細(xì)胞的正常周期和生理過(guò)程產(chǎn)生影響從而引起腫瘤的發(fā)生[7-8]?目前,已有研究證實(shí),miR通過(guò)參于基因調(diào)控影響蛋白表達(dá)水平而影響結(jié)腸癌的進(jìn)展,而且不同的miR在結(jié)腸癌的作用不同,甚至相同的miR在不同類(lèi)型的結(jié)腸癌中的表達(dá)也不相同?

miR-141屬于miR進(jìn)化保守家族的一員,是一種具有上皮組織細(xì)胞特異性的miR?miR-141作為miR-200家族的成員之一,在乳腺癌?前列腺癌中表達(dá)增高,而在肝細(xì)胞肝癌和胰腺癌中表達(dá)降低[9],目前國(guó)內(nèi)關(guān)于miR-141在結(jié)腸癌中表達(dá)的研究不多?本文結(jié)果提示miR-141在結(jié)腸癌組織中顯著高表達(dá)?并且作者發(fā)現(xiàn)隨著結(jié)腸癌分化程度的降低結(jié)腸癌組織中miR-141的表達(dá)增高,其表達(dá)量的上調(diào)在診斷結(jié)腸癌的分化程度方面有較高的敏感性,這提示miR-141可作為結(jié)腸癌腫瘤分化程度的一個(gè)良好的輔助指標(biāo)?本文研究還發(fā)現(xiàn)在miR-141的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.05),推測(cè)它可能作為癌基因參與結(jié)腸癌的進(jìn)展過(guò)程,它通過(guò)負(fù)性抑制抑癌基因和/或通過(guò)控制細(xì)胞的分化或凋亡途徑來(lái)促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展?提示miR-141可能作為癌基因在結(jié)腸癌的進(jìn)展階段起作用,可以反映結(jié)腸癌進(jìn)展程度,具有臨床病理學(xué)診斷價(jià)值,也可以作為判斷結(jié)腸癌腫瘤預(yù)后的一個(gè)輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)?但本文研究發(fā)現(xiàn)miR-141的表達(dá)和結(jié)腸癌腫塊大小無(wú)關(guān),提示在腫塊生長(zhǎng)過(guò)程中miR-141可能不參與或不發(fā)揮作用?

本文結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中miR-141的高表達(dá),這為后期研究miR-141在結(jié)腸癌腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用提供了科學(xué)依據(jù)?截止目前,結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制仍不明確,miR-141的出現(xiàn)為結(jié)腸癌的研究提供了新的切入點(diǎn)?

[1] 陳春曉.miRNA與消化系統(tǒng)腫瘤的關(guān)系[J].醫(yī)學(xué)綜述,2011,17(17):2599-2602.

[2] Liu M,Chen HP.The role of microRNAs in colorectal cancer[J].JGG,2010,37(6):347-358.

[3] Blenkiron C,Miska EA.miRNAs in cancer:approaches,aetiology,diagnostics and therapy[J].Hum Mol Genet,2007,16(1):106-113.

[4] Cheng H,Zhang L,Cogdell DE,et al.Circulating plasma MiR-141is a novel biomarker for metastatic colon cancer and predicts poor prognosis[J].PLoS One,2011,6(3):e17745.

[5] Gregory RI,Shlekhattar R.MicroRNA biogenesis and cancer[J].Cancer Res,2005,65(9):3509-3512.

[6] Guo H,Ingolia NT,Weissman JS,et al.Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels[J].Nature,2010,466(738):835-840.

[7] 徐 瑞 斯,張 斌.miR-31在 人 結(jié) 腸 癌 細(xì) 胞 系 HT-29 對(duì)RhoBTB1表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2013,17(2):267-269.

[8] 劉博,田延鋒,趙增仁,等.微小RNA-187*在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)癌癥雜志,2013,23(9):703-708.

[9] Resnick KE,Alder H,Hagan JP,et al.The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform[J].Gynecol Oncol,2009,112(1):55-59.

R735.35

B

1671-8348(2015)16-2250-03

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.16.032

2014-10-08

2015-01-16)

?調(diào)查報(bào)告?