王方方，杜風光，劉鉞，徐靈鶴，姜超，張鵬飛

（河南天冠企業(yè)集團有限公司，河南南陽473000）

吸附菌體的霉菌篩選試驗

王方方，杜風光，劉鉞，徐靈鶴，姜超，張鵬飛

（河南天冠企業(yè)集團有限公司，河南南陽473000）

探索出一種新的吸附發(fā)酵液中菌體的方法。以曲霉菌作為試驗菌株對異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液進行吸附試驗，通過霉菌篩選試驗找出一株吸附效果良好的黑曲霉，并得出最佳的吸附條件為發(fā)酵液初始糖含量3.0 g/100 mL，小球藻初始質(zhì)量濃度10.0 g/L，在此條件下接種后24～72 h霉菌的吸附能力最強，發(fā)酵液的質(zhì)量濃度下降38.69%，吸光度值下降32.34%。通過酵母菌發(fā)酵液試驗黑曲霉的吸附效果得到進一步驗證。

黑曲霉；吸附；小球藻；酵母菌

生物發(fā)酵的最終目標是獲取目的產(chǎn)物，大部分發(fā)酵過程的目的產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中，首先要對發(fā)酵液固液分離，然后才能進行進一步的提取。但傳統(tǒng)的固液分離方法存在諸多弊端[1]。

小球藻作為一種生物質(zhì)能源的原料，具有生長速度快、生長周期短、油脂含量高（15%～80%）、對土地資源依賴小等諸多優(yōu)勢[2-3]，小球藻生物柴油沒有迅速產(chǎn)業(yè)化的原因在于生產(chǎn)成本高[4]。由于小球藻個體微?。?～30 μm）、含水量＞90%，在小球藻生物柴油成本構(gòu)成中，小球藻生物質(zhì)收集成本占20%～30%[5]，對小球藻生物柴油產(chǎn)業(yè)應用影響較大。目前報道的小球藻的收集方法有篩網(wǎng)過濾法、離心固液分離法[6]、絮凝沉淀法[7-8]、氣浮法[9-10]等，但是篩網(wǎng)過濾法僅適用于螺旋藻，絮凝沉淀法對于大面積培養(yǎng)操作困難，氣浮法受天氣影響較大，離心固液分離法能耗高，因此尋找一種綠色環(huán)保的收集工藝十分重要[11]。

霉菌是一些絲狀真菌的統(tǒng)稱，霉菌菌體由分枝或不分枝的菌絲構(gòu)成[12]。菌絲粗大，直徑約2～10 μm，比一般細菌和放線菌菌絲大幾到幾十倍。霉菌帶有的菌絲或菌絲體容易將接觸到的物體包裹起來，形成大的細胞團，從而沉降下來，如霉菌可以吸附水體中重金屬如Cd（II）、Cr（VI）、Pb2+等[13-15]。因此可以利用這種特性收集菌體，從而實現(xiàn)固液分離。

本試驗利用黑曲霉、黃曲霉、亮白曲霉和灰綠曲霉開展發(fā)酵液中小球藻菌體細胞的收集工作，篩選出具有較好成團特性的霉菌，并對異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液不同初始糖含量及不同初始質(zhì)量濃度進行了試驗，并通過酵母菌發(fā)酵液進行了試驗驗證，為小球藻的收集提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酵母粉、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；葡萄糖、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、甘氨酸：天津科密歐化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.2 菌種

黑曲霉（As 3.388 2）、黃曲霉（As 3.395 0）、亮白曲霉（As 3.645 7）、灰綠曲霉（As 3.547）：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 培養(yǎng)基

小球藻培養(yǎng)基：磷酸一氫鉀0.5g/L、磷酸二氫鉀0.4g/L、硫酸鎂0.2 g/L、甘氨酸0.1 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母粉2 g/L，pH值自然。

酵母菌培養(yǎng)基：將大米和大麥芽按1∶3的質(zhì)量比混合，大米首先蒸熟，然后與大麥芽混勻后于60～65℃糖化4～6 h后過濾，調(diào)至所需濃度，pH值自然。

以上培養(yǎng)基均經(jīng)過121℃、30 min滅菌后使用。

1.2 儀器與設備

SHP-80D生化培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；ZWY-211C恒溫振蕩培養(yǎng)器：上海智城有限公司；2100分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；Primo star顯微鏡：德國卡爾蔡司公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 霉菌的篩選

異養(yǎng)小球藻500 mL發(fā)酵液在搖床培養(yǎng)7 d，調(diào)整葡萄糖含量以及發(fā)酵液菌體質(zhì)量濃度后分別接入4種霉菌，接入方式為斜面直接挑一環(huán)接入，接種后于搖床30℃、200r/min培養(yǎng)，培養(yǎng)期間觀察發(fā)酵液中有無成團現(xiàn)象。發(fā)酵結(jié)束將效果好的霉菌發(fā)酵液靜置4～6 h，取上清液，比較上清液的澄清度。

1.3.2 發(fā)酵液最適初始葡萄糖含量試驗

取50 L發(fā)酵罐中的成熟小球藻發(fā)酵液，取5 mL發(fā)酵液檢測葡萄糖含量，通過補加烘干過的固體葡萄糖調(diào)整發(fā)酵液的初始糖含量，將發(fā)酵液中葡萄糖含量分別調(diào)整至0.25 g/100 mL、0.8 g/100 mL、2.0 g/100 mL、3.0 g/100 mL、4.0g/100mL，每個梯度做3個平行樣，每瓶裝液量為500mL，斜面挑取一環(huán)霉菌接入，接種后于搖床30℃、200 r/min培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液用一次性紗布單層過濾，對濾液的吸光度值、菌體質(zhì)量濃度、葡萄糖含量等參數(shù)進行檢測。

1.3.3 小球藻發(fā)酵液最適初始質(zhì)量濃度試驗

取50L發(fā)酵罐中的成熟小球藻發(fā)酵液，取10mL發(fā)酵液測定菌體質(zhì)量濃度，通過補加無菌水的方式將發(fā)酵液中小球藻質(zhì)量濃度分別調(diào)整至2.0g/L、10.0g/L、18.0g/L、36.0g/L，每個梯度做3個平行樣，每瓶裝液量為500 mL，斜面挑取一環(huán)霉菌接入，接種后于搖床30℃、200 r/min培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液用一次性紗布單層過濾，對濾液的吸光度值、菌體質(zhì)量濃度、葡萄糖含量等參數(shù)進行檢測。

1.3.4 小球藻發(fā)酵液接入霉菌的最佳培養(yǎng)時間試驗

為了考察霉菌接入小球藻發(fā)酵液的最佳培養(yǎng)時間，將初始糖含量為3.0g/100mL，小球藻初始質(zhì)量濃度為10.0g/L的發(fā)酵液中接入霉菌，跟蹤記錄每24 h的發(fā)酵液濾質(zhì)量濃度和吸光度值。

1.3.5 測定方法[16]

（1）發(fā)酵液中小球藻含量測定

將發(fā)酵液搖勻后，用10 mL移液管精確吸取發(fā)酵液10 mL，完全放入離心管中，3 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，沉淀用蒸餾水充分搖勻后再次離心，然后將上清液棄去，沉淀用少量蒸餾水洗至平皿中，105℃干燥箱內(nèi)干燥4 h稱質(zhì)量，發(fā)酵液中小球藻含量的計算公式為：

式中：M1為干燥狀態(tài)的空平皿稱質(zhì)量，g；M2為沉淀物于105℃干燥箱內(nèi)干燥4 h，稱得平皿與菌體的質(zhì)量，g。

（2）糖含量測定

發(fā)酵液中可利用的糖為葡萄糖，葡萄糖的測定通過高效液相色譜法進行。發(fā)酵液3 000 r/min離心后取上清液進行測定。分離柱為AminexHPX-87H（300 mm×7.8 mm），流動相為0.003 mol/L稀硫酸溶液，流速為0.5 mL/min，葡萄糖保留時間為10.34 min，進樣量5 μL，柱溫65℃。糖含量變化量應為發(fā)酵后的糖含量與發(fā)酵前糖含量之差除以發(fā)酵前的糖含量。

（3）吸光度值測定

以發(fā)酵液離心后的上清液作為參比液，將上清液和發(fā)酵液各稀釋相同的倍數(shù)，在波長540 nm處于分光光度計中測定其吸光度值。吸光度值變化量應為發(fā)酵后的吸光度值與發(fā)酵前吸光度值之差除以發(fā)酵前的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌初篩

將保藏的4株霉菌黑曲霉（As 3.388 2），黃曲霉（As 3.395 0），亮白曲霉（As 3.645 7），灰綠曲霉（As 3.547），分別挑取1環(huán)接入培養(yǎng)7 d的小球藻發(fā)酵液中，并于搖床上繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30℃、200 r/min，培養(yǎng)結(jié)果見圖1。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，接入黑曲霉和黃曲霉的發(fā)酵液中出現(xiàn)明顯的成團現(xiàn)象。

2.2 霉菌的進一步優(yōu)選

對霉菌初篩試驗中具有明顯成團現(xiàn)象的黑曲霉和黃曲霉進行對比試驗。異養(yǎng)小球藻發(fā)酵液中初始葡萄糖含量分別為0.2 g/100 mL、0.7 g/100 mL和2.0 g/100 mL。培養(yǎng)5 d后發(fā)酵液經(jīng)靜置后取上清液，其中2～4號試管初始葡萄糖含量為0.7 g/100 mL，5～8號試管初始葡萄糖含量為2.0 g/100 mL，9、10號試管初始葡萄糖含量為0.2 g/100 mL。2、5、6、10號試管接入霉菌為黑曲霉，3、4、7、8、9號試管接入霉菌為黃曲霉，上清液對比情況見圖2。

從圖2可知，無論發(fā)酵液初始糖含量高低，接種黑曲霉的2、5、6、10號試管的澄清度明顯高于接種黃曲霉的3、4、7、8、9號試管。根據(jù)以上試驗結(jié)果，可以初步斷定黑曲霉對發(fā)酵液中小球藻的吸附效果優(yōu)于黃曲霉。

2.3 發(fā)酵液最適初始葡萄糖含量試驗

通過將小球藻發(fā)酵液初始糖含量調(diào)至不同的梯度進行試驗，發(fā)酵96 h，將發(fā)酵液過濾后檢測濾液的吸光度值、菌體質(zhì)量濃度及葡萄糖含量，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，隨著發(fā)酵液中初始糖含量的增加，菌體質(zhì)量濃度和吸光度值的變化幅度基本呈逐漸增加的趨勢，但是當初始糖含量＞3.0 g/100 mL以后，菌體質(zhì)量濃度增加緩慢，吸光度值已不再增加，因此確定發(fā)酵液的最適初始含糖量為3.0 g/100 mL。

2.4 小球藻發(fā)酵液最適初始質(zhì)量濃度試驗

將黑曲霉接入不同初始質(zhì)量濃度的小球藻發(fā)酵液中，以確定最優(yōu)的發(fā)酵液初始濃度，初始葡萄糖含量為3.0 g/100 mL。發(fā)酵結(jié)束對濾液吸光度值、菌體質(zhì)量濃度進行檢測，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，菌體初始質(zhì)量濃度太低時，霉菌對小球藻的吸附成團效果不理想，但是質(zhì)量濃度并非越高越好。因為隨著菌體初始質(zhì)量濃度的增加，小球藻的生長優(yōu)勢會超過霉菌，發(fā)酵液出現(xiàn)質(zhì)量濃度和吸光度值增加的現(xiàn)象，說明發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)被小球藻利用。因此發(fā)酵液中小球藻的初始質(zhì)量濃度以10.0 g/L為宜。

2.5 小球藻發(fā)酵液接入霉菌的最佳培養(yǎng)時間試驗

為了考察霉菌接入小球藻發(fā)酵液的最佳培養(yǎng)時間，將初始糖含量為3.0 g/100 mL，初始質(zhì)量濃度為10.0 g/L的小球藻發(fā)酵液中接入黑曲霉，跟蹤記錄每天的發(fā)酵液菌體質(zhì)量濃度和吸光度值，結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，在霉菌剛接入發(fā)酵液后，菌體質(zhì)量濃度和吸光度值略有增加，說明小球藻含量略有上升；在培養(yǎng)24 h后，隨著霉菌的不斷生長，發(fā)酵液中出現(xiàn)成團現(xiàn)象，小球藻質(zhì)量濃度和吸光度值明顯下降；在72 h之后，下降速度趨于平緩。說明霉菌聚集小球藻成團的最佳時間是在接種后的24～72 h。從發(fā)酵初始至72 h，小球藻質(zhì)量濃度由10.26 g/L降至6.29 g/L，降幅為38.69%；吸光度值（發(fā)酵液稀釋50倍測定）由0.575降至0.389，降幅為32.34%。

2.6 霉菌吸附小球藻鏡檢結(jié)果

培養(yǎng)過程中霉菌吸附小球藻鏡檢結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，黃曲霉通過菌絲對小球藻的包裹產(chǎn)生吸附作用，黑曲霉良好吸附效果主要是由于其含有大量的菌絲及菌絲體，在菌絲的生長過程中對發(fā)酵液中的小球藻產(chǎn)生環(huán)繞、牽絆，使藻體吸附于菌絲間?？芍谇古囵B(yǎng)96 h包裹小球藻的效果好。

2.7 霉菌對酵母菌的成團效果

將黃曲霉和黑曲霉接入含有酵母菌的成熟培養(yǎng)液中，搖瓶培養(yǎng)，定時取樣，測定酵母菌的質(zhì)量濃度值，結(jié)果見表3。

由表3可以看出，接種霉菌后，濾液中酵母菌質(zhì)量濃度均下降，但是接種黑曲霉48h后菌體的濾液質(zhì)量濃度低于接種黃曲霉48h后的質(zhì)量濃度，即霉菌對酵母菌也有一定的吸附效果，且黑曲霉對酵母菌的吸附成團效果優(yōu)于黃曲霉。

3 結(jié)論

將4株霉菌黑曲霉（As 3.388 2），黃曲霉（As 3.395 0），亮白曲霉（As 3.645 7），灰綠曲霉（As 3.547）接入小球藻發(fā)酵液中，黑曲霉和黃曲霉對小球藻具有明顯的成團現(xiàn)象；將黑曲霉和黃曲霉接入不同初始糖含量的小球藻發(fā)酵液中，在消耗相當量的葡萄糖的情況下，黑曲霉的吸附效果優(yōu)于黃曲霉。

對黑曲霉接入小球藻發(fā)酵液的初始糖含量和初始質(zhì)量濃度進行了考察，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵液的初始糖含量為3.0 g/100 mL、初始質(zhì)量濃度為10.0 g/L的條件下，黑曲霉對小球藻的吸附效果最佳。黑曲霉在小球藻發(fā)酵液的生長過程中，其最佳吸附時間是在接種后24～72 h，其具有良好吸附效果的原因是霉菌本身有大量的菌絲和菌絲體。與初始接種相比，小球藻質(zhì)量濃度下降38.69%，吸光度值下降32.34%。

對酵母菌發(fā)酵液進行試驗，黑曲霉對酵母菌的吸附效果也優(yōu)于黃曲霉，其對酵母菌的吸附成團效果不及小球藻，其可能原因是酵母菌發(fā)酵液中含有的乙醇對霉菌的生長有一定的抑制作用。

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WANG Fangfang,DU Fengguang,LIU Yue,XU Linghe,JIANG Chao,ZHANG Pengfei
(Henan Tianguan Group Co.,Ltd.,Nanyang 473000,China)

A novel method for adsorbing thallus in fermentation broth was explored.UsingAspergillussp.as test strains,experiments were carried out in heterotrophic chlorella fermentation broth to screen the optimal strain for chlorella adsorption.Results showed thatA.nigerhad good adsorption effect,and the optimal adsorption condition was initial glucose content 3.0 g/100 ml in fermentation broth,initial chlorella concentration 10.0 g/L. The strongest adsorption capacity was obtained during 24-72 h after inoculation.Under this condition,the concentration of the broth reduced 38.69%, while the absorbance reduced 32.34%.The absorption effect ofA.nigerwas further verified by yeast fermentation experiment.

Aspergillus niger;adsorption;chlorella;yeast

X703

A

0254-5071（2015）04-0114-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.026

2015-03-12

科技支撐計劃項目（2011BAD14B00）

王方方（1983-），女，碩士，主要從事菌種的保藏與篩選工作。