董丹，關統(tǒng)偉，車振明*

（西華大學微生物研究所，食品生物技術四川省高校重點實驗室，四川成都610039）

雜色曲霉最適生長條件及抗藥性實驗研究

董丹，關統(tǒng)偉，車振明*

（西華大學微生物研究所，食品生物技術四川省高校重點實驗室，四川成都610039）

從發(fā)酵8個月豆瓣瓣子中分離獲得1株曲霉，編號為JC1156。經(jīng)真菌18S rRNA分子鑒定該菌為雜色曲霉（Aspergillus versicolor），與其最高同源性菌株的相似度為100%；對該菌的最適生長條件及抗藥性進行研究發(fā)現(xiàn)該菌的最適生長溫度為28℃、pH值為6.0、鹽含量為5%。測定了25種常用抗菌藥物對該菌的抑菌性，結(jié)果顯示，在25種抗菌藥物中，該菌對9種藥物具有抗性；分別為可奇霉素、林可霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、頭孢西丁、妥布霉素、奈替米星、克林霉素以及紅霉素。

雜色曲霉；抗藥性；生長條件

郫縣豆瓣是以豆瓣為原料、霉菌為主要微生物菌種，經(jīng)自然制曲、天然發(fā)酵而成的特色調(diào)味品。傳統(tǒng)的豆瓣生產(chǎn)可大致分為3個階段：發(fā)酵制曲階段、發(fā)酵初期和發(fā)酵后期。豆瓣發(fā)酵過程中的微生物組成相當豐富，不同時期微生物的組成也存在一定的差異。曲霉一般存在于制曲階段和瓣子發(fā)酵初期[1]。曲霉的種類有很多，如黃曲霉（A.flavus）、煙曲霉（A.fumigatus）、灰綠曲霉（A.glaucus）、構(gòu)巢曲霉（A.nidurans）、寄生曲霉（A.parasiticus）、土曲霉（A.terreus）和雜色曲霉（A.versicolor）等。曲霉菌是發(fā)酵工業(yè)和食品工業(yè)的重要菌種，已被利用的近60種，但同時曲霉菌也是造成食物腐敗變質(zhì)的罪魁禍首，其是過敏性哮喘、過敏性鼻炎的常見誘因；雜色曲霉菌為曲霉菌屬的一種，是濕熱的沿海地區(qū)和內(nèi)陸常見的室內(nèi)外致敏真菌[2]。雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉和離蠕孢霉是產(chǎn)生雜色毒素的主要菌種[3]。上述這些霉菌廣泛存在于自然界中，會導致大麥、小麥、玉米、大豆、奶酪等糧食、食品和飼料的污染，尤其是對小麥、玉米的污染最為嚴重。產(chǎn)毒素最高的是雜色曲霉，其次是構(gòu)巢曲霉和離蠕孢霉[4-5]。雜色曲霉毒素（sterigmatocystin，ST）是日本學者YUICHI H等[6]從雜色曲霉菌絲體中首先分離并命名的，當時未引起人們的重視。直至1960年英國爆發(fā)“火雞X病”證實為黃曲霉毒素中毒并有致癌作用[7-11]，從此才對結(jié)構(gòu)與其相似的雜色曲霉毒素引起注意。本實驗從發(fā)酵8個月豆瓣瓣子中分離獲得1株雜色曲霉（Aspergillus versicolor）JC1156，為進一步了解該菌株的生理特性，對其最適生長條件及抗藥性進行了研究，針對目前許多小型豆瓣企業(yè)黃曲霉毒素超標的問題，對豆瓣中產(chǎn)毒素菌株的研究十分有必要，這對未來豆瓣生產(chǎn)中黃曲霉毒素含量的控制及豆瓣產(chǎn)品品質(zhì)的改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

從發(fā)酵8個月豆瓣瓣子中分離得到的曲霉，編號為JC1156，菌株分別以30%甘油管和20%牛奶罐保存于-20℃。

1.1.2 試劑

核酸染料（goldview）、三羧甲基氨基甲烷（Tris堿）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、TE緩沖溶液（Tris-EDTA buffer）：上海生工生物工程有限公司；蛋白胨、甘油、無水乙醇、異戊醇、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、大豆磷脂、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）：成都市科龍劑化工廠；ExTaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphote，dNTP）：大連Takara公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒（離心柱）：捷瑞生物工程（上海）有限公司。

1.1.3 抗菌藥物

本實驗共選用25常用藥敏試紙（鏈霉素、慶大霉素、青霉素G、可奇霉素、林克霉素、多粘菌素B、奈替米星、奈替米星、呋喃妥因、新生霉素、萘啶酸、環(huán)丙沙星、卡那霉素、頭孢西丁、氧氟沙星、復方新諾明、妥布霉素、克林霉素、紅霉素、氯霉素、氨芐西林、羧芐青霉素、諾氟沙星、頭孢噻胯、利福平）：杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）[12]：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，自然pH。

1.2 儀器與設備

LDZX-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺：蘇州凈化有限公司；DHG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱、DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海益恒實驗儀器有限公司；TB-214型電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PHS-3C型酸度計：方舟科技有限公司；9700型PCR擴增儀：美國應用生物系統(tǒng)公司；NGS721型分光光度計：北京中惠天城科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 霉菌的分子鑒定

DNA的提?。篋NA的提取采用改良十六烷基三甲溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）[13-14]法。得到的樣品總DNA于-20℃保存，作為后續(xù)PCR的模板。

PCR及產(chǎn)物的純化：以提取得到的DNA為模板，選擇真菌引物ITS4（5'-CCTCCGCTTATTGATATGC-3'）；ITS5（5'-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。反應條件：95℃、4 min；94℃、30 s，53℃、30 s，72℃、40 s，35個循環(huán)；72℃、7min。PCR反應體系為50μL：10×Buffer5μL、dNTP4μL、Taq酶0.5 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 37.5 μL、DNA模板1 μL。PCR產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳時間40 min。純化過程按照DNA膠回收試劑盒中的步驟進行，具體步驟參照OMEGA公司E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit試劑盒說明。

測序：PCR產(chǎn)物純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果提交NCBI（http：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）進行Blast（Basic Local Alignment Search Tool）序列分析。

1.3.2 菌株母液的制備[15]

在LB斜面培養(yǎng)基上接種供試菌，放入30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h制成斜面種子，然后挑取1環(huán)菌種于裝有20 mL滅菌后的液體PDA培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，置于溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

1.3.3 鹽含量對菌株生長的影響

取0.5 mL菌株母液于裝有20 mL滅菌后的分別加入鹽含量為0、5%、10%、15%、20%的PDA液體培養(yǎng)基中，共5個錐形瓶，置于溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)24 h，以液體PDA培養(yǎng)基作空白對照，用分光光度計測定波長660 nm處的吸光度值。菌株的生長情況越好，菌體密度越大，吸光度值越大。

1.3.4 溫度對菌株生長的影響

取0.5 mL菌株母液于裝有20 mL滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基中，分別置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28 h，以液體PDA培養(yǎng)基為空白對照，用分光光度計測定波長660 nm處的吸光度值。

1.3.5 pH值對菌株生長的影響[16]

將液體PDA培養(yǎng)基分別用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，取0.5 mL菌株母液于裝有20 mL已調(diào)好pH值的液體PDA培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，放入溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)28 h，以液體PDA培養(yǎng)基作空白對照，用分光光度計測定波長660 nm處的吸光度值。

1.3.6 菌株抗藥性檢測

抗菌藥物平板制備：在LB平板上加入100 μL母液，用涂布棒涂均勻后，用標記筆將平板分為五等分，在每個部分放入一張藥敏性試紙，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察有無抑菌圈的產(chǎn)生。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分子鑒定

雜色曲霉經(jīng)PCR凝膠呈像結(jié)果見圖1。

將JC1156測序結(jié)果進行拼接過后，在Genbank數(shù)據(jù)庫進行Blast序列比對，序列號為JX506349，經(jīng)同源性對比與Aspergillus versicolor相似度為100%，結(jié)合《伯杰氏細菌鑒定手冊》以及生理生化鑒定和分子生物學鑒定，最終確定JC1156為Aspergillus versicolor。

2.2 菌株最適生長條件研究結(jié)果

2.2.1 鹽含量對菌株生長的影響

高鹽環(huán)境能抑制微生物的生長繁殖，當微生物浸泡在高鹽環(huán)境中時會因為細胞內(nèi)外滲透壓過大，導致細胞內(nèi)部嚴重失水直至微生物的死亡。鹽含量對菌株JC1156生長的影響見圖2。

由圖2可看出，鹽含量為0～5%時，隨著鹽含量的增加，菌體密度逐漸增大，在鹽含量為5%時，菌體密度達到最大值，鹽含量＞5%后，隨著鹽含量的升高，菌體密度逐漸降低。表明適宜的鹽含量有利菌株的生長。菌株JC1156雜色曲霉最適生長鹽含量為5%。

2.2.2 溫度對菌株生長的影響

溫度的高低影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝，過高的溫度會導致蛋白質(zhì)或核酸的變性失活，而過低的溫度會使酶活力受到抑制，細胞的新陳代謝活力減弱[17]。不同溫度對菌株生長的影響結(jié)果見圖3。

由圖3可看出，溫度在24～28℃內(nèi)，隨著溫度的升高，菌體密度逐漸增大，當溫度為28℃時，菌體密度最大，當溫度＞28℃后，隨著溫度的升高，菌體的密度逐漸降低。表明適宜的溫度有益于菌株的生長。菌株JC1156的最適生長溫度為28℃。

2.2.3 pH值對菌株生長的影響

在最適pH條件下，微生物細胞能達到最高生長率。在此pH值下，微生物的細胞量達到最大，并且細胞生長過程中所需的有關酶的活性也最高。不同pH值對菌株生長的影響結(jié)果見圖4。

由圖4可看出，pH值在4.0～6.0內(nèi)，菌體密度逐漸增大，在pH值為6.0時，菌體密度達到最大，在pH值＞6.0后，隨著pH值的增大，菌體密度逐漸減小。由此得出菌株JC11546生長最適的pH值為6.0。

2.2.4 菌株抗藥性實驗結(jié)果

為了了解該曲霉的藥敏情況，以便為雜色曲霉的防治提供參考依據(jù)，本研究檢測了菌株JC1156對25種抗生素的抗藥性，測定結(jié)果如表1所示。

由表1可以看出，在菌株的抗藥性實驗中，菌株JC1156對9種常用藥物具有抗性，分別為可奇霉素、林可霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、頭孢西丁、妥布霉素、奈替米星、克林霉素以及紅霉素。

3 結(jié)論

本實驗采用純培養(yǎng)的方法從發(fā)酵8個月豆瓣瓣子中分離得到一株曲霉菌，經(jīng)18S rRNA分子鑒定得知該株曲霉為雜色曲霉（Aspergillus versicolor），編號為JC1156。通過對其最適生長條件及抗藥性研究得到該菌的最適生長溫度為28℃、最適生長pH值為6.0、最適生長鹽含量為5%，在抗藥性實驗中，該菌對9種常用藥物都具有抗性。本實驗的研究結(jié)果對于豆瓣中雜色曲霉菌生長的抑制以及雜色曲霉毒素的控制提供了理論依據(jù)，為更好的保證豆瓣生產(chǎn)品質(zhì)奠定基礎。

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DONG Dan,GUAN Tongwei,CHE Zhenming*
(Key Laboratory of Food Biotechnology in Colleges and Universities in Sichuan Province,Institute of Microbiology, Xihuan University,Chengdu 610039,China)

AspergillusJC1156 was isolated from eight months’fermented soybean paste.The strain was identified asAspergillus versicolorby 18S rRNA molecular identification,and it was 100%homology with the highest homology strains.The optimal growth conditions and drug resistance of the strain was studied.The results showed that the optimum condition was temperature 28℃,pH 6.0 and salt concentration 5%.Meanwhile,25 kinds of commonly antibacterial drugs were used to study antibacterial activity of the bacteria.The results showed that the strain was resistant to nine kinds of drugs:spectinomycin,lincomycin,ciprofloxacin,kanamycin,cefoxitin,tobramycin,netilmicin,clindamycin and erythromycin.

Aspergillus versicolor;drug resistance;growing conditions

Q93-331

A

0254-5071（2015）04-0051-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.012

2015-03-24

教育部春暉計劃項目（No.13205639）

董丹（1989-），女，碩士研究生，研究方向為食品加工。

*通訊作者：車振明（1960-），男，教授，本科，研究方向為食品發(fā)酵技術。