鐘 琦，吳慧昊，代軍飛，牛 鋒*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 理科實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730124）

能源作為現(xiàn)代工業(yè)的支柱，是國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的動(dòng)力。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生活水平的日益提高，世界各國(guó)對(duì)能源的要求不斷向著經(jīng)濟(jì)、環(huán)保和可持續(xù)發(fā)展的方向努力。微生物油脂（microbial oils）又稱為單細(xì)胞油脂（single cell oil，SCO），即酵母菌、霉菌、細(xì)菌和藻類等產(chǎn)油微生物在一定條件下，利用碳水化合物、碳?xì)浠衔锖桶被岬确謩e作為碳源和氮源，輔以無機(jī)鹽，在菌體內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂[1]。產(chǎn)油微生物能夠高效利用碳水化合物合成微生物油脂，并且大部分微生物油脂可以替代動(dòng)植物油脂產(chǎn)生生物柴油，從而緩解能源危機(jī)[2]。因此，微生物油脂作為可再生的綠色能源和功能性油脂，已經(jīng)得到越來越多的關(guān)注。微生物生產(chǎn)油脂具有眾多優(yōu)點(diǎn)[3-4]：（1）微生物生長(zhǎng)周期短，適應(yīng)性強(qiáng)，代謝旺盛，培養(yǎng)簡(jiǎn)單；（2）微生物易于遺傳物質(zhì)的改良，能大幅度提高產(chǎn)量的同時(shí)，還能得到符合人類需要的功能性脂肪酸，如二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、γ-亞麻酸（gamma linolenic acid，GLA）等；（3）微生物生產(chǎn)油脂可利用農(nóng)副產(chǎn)品、食品加工的廢棄物作為培養(yǎng)基原料，有利于廢棄物的再利用和環(huán)境保護(hù)；（4）微生物油脂生物安全好，毒副作用??；（5）微生物生產(chǎn)油脂不受場(chǎng)地和季節(jié)限制，能夠連續(xù)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；（6）微生物比高等植物更能有效地積累油脂。

油脂提取技術(shù)是決定微生物油脂能否廣泛應(yīng)用的重要因素之一。因此，研究油脂提取相關(guān)工藝技術(shù)及方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文重點(diǎn)對(duì)油脂提取技術(shù)進(jìn)行分類介紹，并對(duì)其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行分析。

1 微生物油脂的組成特點(diǎn)

微生物油脂主要由多不飽和脂肪酸組成，包括亞油酸（leinoleic acid，LA）、γ-亞麻酸、花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸等[5]。這些不飽和脂肪酸對(duì)人類的健康具有重要的生理作用，如LA不僅對(duì)癌癥、粥狀動(dòng)脈硬化具有一定的防治作用，還能參與脂肪的新陳代謝，增強(qiáng)免疫[6]；GLA對(duì)粥樣動(dòng)脈硬化、血栓性心腦血管和腫瘤具有預(yù)防作用，還對(duì)消炎殺菌、降血脂和糖尿病具有一定的療效[7]；ARA對(duì)脂蛋白代謝、血管彈性、白細(xì)胞功能、血小板激活等具有重要的調(diào)節(jié)作用[8]；DHA具有健腦益智、促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)和視覺發(fā)育、防治心血管疾病和調(diào)節(jié)免疫等功能[9]。

多不飽和脂肪酸對(duì)人體免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)都具有重要而廣泛的生理功能。同時(shí)，全球性能源短缺及環(huán)境惡化使得微生物油脂廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和生物能源等方面。

2 國(guó)內(nèi)外微生物油脂研究現(xiàn)狀

國(guó)外對(duì)微生物油脂的研究工作已有半個(gè)多世紀(jì)。在20世紀(jì)80年代末，英國(guó)和日本首先推出含GLA的微生物油脂的功能性飲料、醫(yī)療保健食品和高級(jí)化妝品[10]。目前，美國(guó)、日本和歐洲等國(guó)家已有微生物油脂面市。

我國(guó)對(duì)微生物油脂產(chǎn)業(yè)的研究相對(duì)較落后，大部分研究還處于實(shí)驗(yàn)室或者中試階段。趙春海[11]用菊芋根塊水解液分批補(bǔ)料發(fā)酵膠紅酵母，其生物量為19.47 g/L，油脂含量達(dá)52.2%?？紫槔騕12]利用葡萄糖和木糖混合發(fā)酵培養(yǎng)斯達(dá)油脂酵母，其生物量為15.8 g/L，油脂含量達(dá)58.8%。余增亮等[13]在4×200 m3大容器反應(yīng)器中發(fā)酵由離子束誘變的高山被孢霉，其生物量達(dá)38.2 g/L，油脂含量20.67 g/L。提取花生四烯酸后的殘油，經(jīng)過精煉后，還能作為生物柴油。

3 微生物油脂的生產(chǎn)工藝

工業(yè)微生物油脂的生產(chǎn)工藝[14]：

篩選菌種→活化菌種→一級(jí)種子液→二級(jí)種子液→發(fā)酵罐生產(chǎn)→收集菌體→菌體預(yù)處理→油脂提取→油脂產(chǎn)品的制備

工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)微生物油脂的菌株必須具備[15]：（1）具有合成油脂的能力，且油脂積累量大；（2）能進(jìn)行工業(yè)化深層培養(yǎng)；（3）食用安全；（4）生長(zhǎng)速度快；（5）油脂易于提取。通過物理、化學(xué)和生物誘變等技術(shù)改變菌體遺傳物質(zhì)，篩選功能性脂肪酸的高產(chǎn)菌株，已經(jīng)成為產(chǎn)油微生物定向育種的重要方向。

微生物油脂屬于胞內(nèi)產(chǎn)物，對(duì)菌體的預(yù)處理是提取微生物油脂的關(guān)鍵步驟之一。微生物具有致密的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，在油脂提取前需要對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理的方法包括：摻沙共磨法、菌體自析法、酸熱法、酶解法、超聲波法、反復(fù)凍融法和微波法等。預(yù)處理菌體細(xì)胞，可以使油脂更容易的萃取，縮短萃取時(shí)間和成本。

4 微生物油脂的提取方法

4.1 超臨界CO2萃取法（supercritical CO2fluid extraction）

以CO2為超臨界流體，利用其強(qiáng)溶解性、高擴(kuò)散性、低黏性，良好的流動(dòng)性和擴(kuò)散性等特點(diǎn)，通過調(diào)整CO2的溫度和壓力，可以選擇性的進(jìn)行油脂提取[16]。利用超臨界CO2萃取的油脂，不僅具有純度高、色澤好、無有機(jī)溶劑的殘留、無污染等優(yōu)點(diǎn)[17]，而且能選擇性的分離不飽和脂肪酸，并保持其生物活性[5]。因此，超臨界CO2萃取法是目前常用的微生物油脂提取技術(shù)。

王錦秀等[18]采用超臨界CO2萃取法，以微藻粉為原料，在萃取壓力30 MPa，萃取溫度35 ℃和萃取時(shí)間180 min的條件下，最大得油率在8%以上。王莉娟等[19]在壓力20 MPa，時(shí)間120 min和提取溫度40 ℃的條件下萃取被孢霉油脂，最大油脂得率為46.08%。

4.2 有機(jī)溶劑萃取法（organic solvent extraction）

根據(jù)相似相溶原理，油脂易溶于非極性有機(jī)溶劑，如氯仿、乙醚和石油醚等溶劑，通過長(zhǎng)時(shí)間浸泡，將油脂提出。常用的有機(jī)溶劑萃取法有氯仿-甲醇法和乙醚-石油醚法。有機(jī)溶劑萃取法具有操作方法簡(jiǎn)單、所需設(shè)備簡(jiǎn)單和得油率高的優(yōu)點(diǎn)，但是油脂成分純度較低。

蒿珍珍[20]先用鹽酸疏松皮狀絲孢酵母的細(xì)胞壁，在沸水浴和速冷的條件下破壞細(xì)胞壁，以氯仿-甲醇作為萃取溶劑，獲得最大油脂得率為32.2%。孫曉璐等[21]采用酸熱法破碎細(xì)胞，分別以乙醚-石油醚、氯仿-甲醇作為萃取溶劑，結(jié)果顯示前一方法提取效果優(yōu)于后者，其油脂得率達(dá)29.8%。GALAFASSI S等[22]以未解毒的玉米秸稈水解液作為培養(yǎng)基，采用恒定細(xì)胞破碎系統(tǒng)破碎紅酵母，再用乙烷∶異丙醇（3∶2）提取油脂，其油脂含量為0.21 g/L，油脂得率為34%。

4.3 索氏抽提法（Soxhlet extraction method）

索氏抽提法作為脂肪提取的經(jīng)典方法，是利用乙醚等低熔沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑長(zhǎng)時(shí)間重復(fù)回流，將干菌細(xì)胞中油脂全部提出，是實(shí)驗(yàn)室常用的油脂提取方法。雖然提取比較充分，但是耗時(shí)長(zhǎng)，樣品處理量少。除了脂溶性脂肪外，還能將磷脂、脂肪酸、固醇和芳香油等提出，使得得到的油脂含量比實(shí)際油脂含量偏高[23]。ZHU M等[24-25]都通過試驗(yàn)證明干菌得油率明顯高于濕菌得油率。

張鵬鵬[23]提取深黃被孢霉油脂時(shí)，得到索氏抽提法在產(chǎn)油量和油脂得率方面均明顯高于酸熱法，其產(chǎn)油量達(dá)6.81 g/L，油脂得率為53.47%。趙春海[11]利用發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)膠紅酵母菌株，用索氏抽提法提取細(xì)胞油脂，其生物量達(dá)19.47 g/L，油脂得率為52.21%。

4.4 酸熱法（acid-hot method）

酸熱法主要是利用酸將由糖和蛋白質(zhì)等組成的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變得疏松，再在沸水浴和速冷的作用下進(jìn)一步破壞細(xì)胞壁，從而有利于油脂提取。酸熱法將破碎細(xì)胞和油脂提取結(jié)合，提高了油脂提取能力，操作簡(jiǎn)單、快速，對(duì)設(shè)備要求不高，且在短時(shí)間內(nèi)可以處理大量樣品。

耿青偉[26]比較了不同提取方法對(duì)斯達(dá)油脂酵母提取油脂效果的影響，結(jié)果顯示，以酸熱法提取油脂的得油率最高，其最高油脂得率為21.36%?？追裁舻萚27]通過酸熱法對(duì)油脂酵母提取條件進(jìn)行研究，確定每0.5 g干菌體用10 mL 4 mol/L鹽酸沸水浴8 min，再加入10 mL無水乙醇和24 mL乙醚∶石油醚（1∶1），最高油脂提取率為39.87%。

4.5 酶解輔助萃?。╡nzymatic assisted extraction）

酶解輔助萃取法是利用微生物細(xì)胞壁成分的差異，用不同的酶破壞細(xì)胞壁，再將油脂提出。蝸牛酶、纖維素酶和溶菌酶是實(shí)驗(yàn)室常用于破壞細(xì)胞壁的酶。利用酶解處理細(xì)胞壁，具有操作簡(jiǎn)便，條件溫和，不會(huì)破壞細(xì)胞原有的特定油脂成分。

王莉等[25]研究不同油脂提取工藝對(duì)產(chǎn)油酵母油脂產(chǎn)率的影響，結(jié)果顯示，先用10 mg/mL蝸牛酶破碎產(chǎn)油酵母JM-D的細(xì)胞壁，再用有機(jī)溶劑進(jìn)行油脂提取的方法最好，最高油脂得率為46.2%。張秋紅[28]利用纖維素酶，在pH 4.10，酶解溫度37.9 ℃，酶用量0.16%和酶解1.86 h的條件下破壞眼點(diǎn)擬微綠球藻細(xì)胞壁，再進(jìn)行油脂提取，其油脂提取率達(dá)（38.69±0.15）%。

4.6 超聲波輔助萃?。╱ltrasonic assisted extraction）

超聲波輔助萃取是利用超聲波對(duì)媒介產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用，以達(dá)到破碎細(xì)胞的一種物理破碎方法[29]。超聲波破碎細(xì)胞的方法簡(jiǎn)單，且提取率較高。在使用超聲波輔助萃取時(shí)，需要控制細(xì)胞密度，否則會(huì)影響細(xì)胞的破碎效果[30]。

王敏等[31]采用酸熱耦合超聲波提取粘紅酵母油脂時(shí)，在提取液比1.9∶1，酸處理34 min，超聲波處理7.5 min的條件下，使1 g濕菌的油脂質(zhì)量從42 mg增加至57.33 mg，油脂提取率提高了36.5%。馬千然[32]在超聲波功率1 680 W時(shí)，超聲處理Y3小球藻細(xì)胞15 min，再用有機(jī)溶劑萃取，其濕菌體的油脂產(chǎn)量達(dá)13.2%。

4.7 反復(fù)凍融輔助萃取（repeated freeze-thaw extraction）

反復(fù)凍融法是指將待破碎的細(xì)胞在-20 ℃條件下迅速冷凍，然后放于室溫或更高溫度迅速融化，如此反復(fù)多次，細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶使細(xì)胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞破碎的方法。操作簡(jiǎn)單，成本低，可以高密度大規(guī)模的提取微生物油脂，但是操作過程比較長(zhǎng)，耗費(fèi)人力。

王莉等[25]將產(chǎn)油酵母菌的菌懸液冷凍12 h后，于沸水浴、室溫和微波爐中解凍，反復(fù)3次，結(jié)果顯示沸水浴解凍破碎細(xì)胞提取的油脂產(chǎn)率最高，其油脂提取率為43.4%。杜曉鳳等[33]通過反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞提取微綠球藻油脂，得到最大油脂提取率為23.86%。

4.8 微波輔助萃?。╩icrowave assisted extraction）

微波輔助萃取主要是利用微波輻射可以使細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)，如水吸收微波而使細(xì)胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化時(shí)產(chǎn)生的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破，形成微小的孔洞，使細(xì)胞內(nèi)的成分自由流動(dòng)，從而再進(jìn)行油脂提取[34]。微波輔助萃取具有提取時(shí)間短、耗能低、安全可靠、成本低和可同時(shí)處理多個(gè)樣品等多個(gè)優(yōu)良特性[35]，但是在微波過程中提取液溫度會(huì)增加，會(huì)導(dǎo)致某些脂肪酸成分損失。

LEE J Y等[36]利用高壓均質(zhì)、陶瓷珠振蕩、超聲及滲透休克等方法從叢粒藻（Botryococcussp.），小球藻（Chlorella vulgaris）和柵藻（Scenedesmussp.）3種微藻中提取油脂，發(fā)現(xiàn)微波輔助對(duì)3種微藻的油脂提取率最高。BALASUBRAMANIAN S等[37]以正己烷作溶劑，利用連續(xù)微波萃取系統(tǒng)，其油脂提取率達(dá)76%～77%。

5 產(chǎn)業(yè)化前景及展望

超臨界CO2萃取法、有機(jī)溶劑萃取法、索氏抽提法、酸熱法、酶解輔助萃取、超聲波輔助萃取、反復(fù)凍融輔助萃取和微波輔助萃取均可適用于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下微生物油脂的提取，但超臨界CO2萃取法需要專業(yè)設(shè)備，索氏抽提法提取時(shí)間較長(zhǎng)，且處理量相對(duì)較少，工業(yè)生產(chǎn)成本較高，不適合工業(yè)生產(chǎn)。而反復(fù)凍融輔助萃取操作繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間，在工業(yè)生產(chǎn)過程中難以大規(guī)模應(yīng)用。微波輔助萃取和超聲波輔助萃取在油脂提取過程中只要控制處理溫度，再輔以有機(jī)溶劑萃取，可以用于工業(yè)大規(guī)模油脂生產(chǎn)。在最適pH值和溫度的條件下，酶解輔助萃取操作簡(jiǎn)單，得油率高，也可用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)油脂。

產(chǎn)油微生物的功能性油脂合成及代謝調(diào)控機(jī)制已經(jīng)逐漸清晰，油脂提取技術(shù)會(huì)逐漸向環(huán)保、安全和高效的方向發(fā)展。如利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)，對(duì)油脂微生物進(jìn)行篩選，以提高其油脂產(chǎn)量和功能性脂肪酸的積累速度。同時(shí)，利用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，研究先進(jìn)的發(fā)酵工藝，在降低成本的同時(shí)，提高產(chǎn)油微生物油脂產(chǎn)量，為油脂的工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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