劉飛飛，秦貴信*，孫澤威，王濤，于文雅，張琳，孫喆，袁志杰

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2.動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118）

動物腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收的研究方法進(jìn)展

劉飛飛1，2，秦貴信1，2*，孫澤威1，王濤1，于文雅1，2，張琳1，2，孫喆3，袁志杰1，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118；2.動物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118）

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場所，營養(yǎng)物質(zhì)在腸道內(nèi)的消化吸收是決定養(yǎng)分高效利用的重要因素?？茖W(xué)的腸吸收研究方法可以明確腸上皮對營養(yǎng)物質(zhì)的有效吸收部位、吸收效率及吸收機(jī)制，并獲得營養(yǎng)物質(zhì)在腸道的吸收動力學(xué)參數(shù)。本文對目前應(yīng)用較多的在體法（血管插管法和小腸灌注法）及體外法（外翻腸囊法、刷狀緣膜囊法、尤斯灌流法和體外細(xì)胞模型法）進(jìn)行了綜述，為營養(yǎng)物質(zhì)的吸收研究提供參考。

腸道；養(yǎng)分吸收方法；血插管；小腸灌注；外翻腸囊；體外細(xì)胞模型

小腸是營養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位，營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過小腸上皮細(xì)胞的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制共有4種：被動轉(zhuǎn)運(yùn)、膜動轉(zhuǎn)運(yùn)、載體偶聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞旁路通路轉(zhuǎn)運(yùn)［1-2］。營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)是一個非常復(fù)雜的過程，某種營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)形式可能是一種，也可能是多種。但根據(jù)轉(zhuǎn)運(yùn)至腸腔內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)的種類、理化性質(zhì)和數(shù)量、被消化酶的降解程度以及吸收部位形態(tài)結(jié)構(gòu)和小腸通透性的不同，其吸收機(jī)制也會有相應(yīng)改變［3-4］。在神經(jīng)體液機(jī)制的調(diào)控下，胃腸道及機(jī)體各個部分協(xié)調(diào)配合才能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)全面有效地被吸收。以往研究營養(yǎng)物質(zhì)吸收方法主要是體內(nèi)法，但體內(nèi)試驗(yàn)法不能全面的了解某種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收動力學(xué)情況。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多用于研究藥物吸收的方法也廣泛的應(yīng)用于動物營養(yǎng)學(xué)研究，主要有在體法（in situ）和體外法（in vitro）。本文對近年來動物營養(yǎng)物質(zhì)吸收研究的方法及應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 在體法

在體法研究營養(yǎng)物質(zhì)的吸收的優(yōu)點(diǎn)是能夠提供完整的小腸、血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)以及影響?zhàn)B分吸收的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)載體，但是這種方法需要有復(fù)雜的外科手術(shù)技術(shù)，難度較大。

1.1 血插管法動物機(jī)體的營養(yǎng)代謝是一個不斷變化的動態(tài)過程。近幾年，在動物營養(yǎng)生理研究工作中需要深入研究機(jī)體組織器官的代謝變化時，研究者采用多血重血插管（門靜脈、腸系膜靜脈、肝靜脈、股靜脈和股動脈血管）技術(shù)來定量地研究各種營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)在動物體內(nèi)的變化，系統(tǒng)地了解營養(yǎng)物質(zhì)代謝物進(jìn)入或流出某器官或組織的總量，結(jié)合血流量即可獲得營養(yǎng)物質(zhì)在某組織的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。血插管技術(shù)能夠比較全面地評價機(jī)體的代謝狀況，對國內(nèi)外動物營養(yǎng)研究工作具有重要意義。目前，以豬和羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動物的頸動脈-門靜脈-腸系膜靜脈插管手術(shù)已較為成熟［5-6］。Zeng等［7］給豬進(jìn)行肝門靜脈血管瘺手術(shù)，在豬采食前后的不同時間點(diǎn)取門靜脈血液，發(fā)現(xiàn)日糧不同賴氨酸水平顯著影響生長豬門靜脈血清氨基酸及血液生化指標(biāo)的變化。Li等［8］采用門靜脈和頸動脈血插管技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)日糧淀粉來源影響葡萄糖和氨基酸的吸收利用，其中玉米淀粉組、糯米淀粉組、糙米淀粉組和抗性淀粉組采食8 h后門靜脈氨基酸凈吸收量分別為63.76%、61.80%、59.81%和48.39%，并且抗性淀粉組較其他組葡萄糖的吸收率低。戴求仲［9］采用多重血插管技術(shù)研究不同淀粉來源的日糧對生長豬門靜脈葡萄糖、氨基酸、揮發(fā)性脂肪酸及乳酸凈吸收量的影響，比較分析了不同消化速率的淀粉對營養(yǎng)物質(zhì)吸收時間和劑量的差異，從而為合理的搭配谷物飼料與蛋白質(zhì)飼料的平衡提供理論指導(dǎo)。王子榮等［10］采用多重血插管技術(shù)研究外源性半胱胺對山羊門靜脈血液和激素流量，碳氮化合物腸道吸收及肝臟代謝的影響，探討了外源性半胱胺在山羊體內(nèi)的吸收代謝動力學(xué)特征。由上述研究可以發(fā)現(xiàn)，血插管技術(shù)在研究機(jī)體復(fù)雜的營養(yǎng)代謝的動態(tài)過程中具有獨(dú)特優(yōu)勢，通過這種技術(shù)可深入了解營養(yǎng)物質(zhì)在動物機(jī)體內(nèi)腸道吸收動力學(xué)的差異機(jī)制，為科學(xué)地研究營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用提供技術(shù)支持。

1.2 小腸灌注法小腸灌注法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收研究。此種方法可以直接測定營養(yǎng)物質(zhì)從灌注腸段中進(jìn)入腸壁和機(jī)體的量。小腸灌注法實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是在動物血管和神經(jīng)的支配下，養(yǎng)分透過腸上皮細(xì)胞后被血液運(yùn)走，更接近于動物正常的生理狀態(tài)，而較其他體內(nèi)的方法，此方法能研究不同腸段的吸收機(jī)制。于紅霞等［11］給山羊從十二指腸瘺管灌注亮氨酸，發(fā)現(xiàn)不同濃度的亮氨酸可直接長期調(diào)控山羊胰腺α-淀粉酶的分泌，從而影響?zhàn)B分的吸收利用。哈斯額爾敦［12］采用十二指腸瘺管研究奶牛瘤胃后泌乳所需的18碳脂肪酸的需要量，研究表明，亞麻酸與油酸和亞油酸均可顯著改變?nèi)橹舅峤M成，為進(jìn)一步日糧調(diào)控乳脂組成提供理論依據(jù)。

2 體外法

2.1 外翻腸囊法Wilson等［13］利用外翻腸囊法研究小腸的吸收和代謝以來，該技術(shù)逐漸應(yīng)用于動物營養(yǎng)學(xué)研究，尤其在腸道營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)領(lǐng)域得到應(yīng)用［14］。該方法一般采用10 cm左右的小腸段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［15］，用緩沖液沖洗去除內(nèi)容物后將腸段外翻形成腸囊，并向腸囊中注入不含待測物的培養(yǎng)液，然后置于含有待測物的孵育液中，同時通入95%O2和5% CO2的混合氣體，孵育一定時間后，根據(jù)腸囊內(nèi)外待測物質(zhì)的變化來反映腸道對該物質(zhì)的吸收情況。但是隨著孵育時間的延長，腸黏膜上皮的完整性逐漸受到破壞，因此，腸黏膜細(xì)胞的持續(xù)存活時間是關(guān)鍵。研究表明［16］，腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)在37℃有氧孵育5 min后會產(chǎn)生明顯的變化，隨著孵育時間的延長，腸黏膜邊緣逐漸受到破壞。有研究報(bào)道，與普通大鼠相比，23℃孵育條件下金色倉鼠的外翻腸囊的腸上皮完整性持續(xù)時間更長。

外翻腸囊法也廣泛的應(yīng)用于動物體內(nèi)葡萄糖、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。Mahomoodally等［17］采用外翻腸囊法孵育不同濃度的苦瓜提取物，研究大鼠上皮組織對葡萄糖、酪氨酸吸收的能力。Berge等［18］利用外翻腸囊法研究大西洋鮭魚體外氨基酸吸收動力學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-蛋氨酸在孵育液中的濃度較低時（2.5 mmol/L），其吸收受到其他氨基酸的抑制，而高濃度時（10～25 mmol/L），單獨(dú)蛋氨酸的吸收和與其他氨基酸共同吸收的效率相同，然而去除孵育液中其他的中性氨基酸時，蛋氨酸的吸收受到明顯抑制。許多研究者利用外翻腸囊法培養(yǎng)動物腸道研究微量元素的吸收情況。計(jì)峰等［19］用外翻腸囊法研究肉仔雞十二指腸、空腸和回腸對無機(jī)錳和有機(jī)錳的吸收特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)回腸是肉仔雞小腸吸收錳的主要部位，且體外培養(yǎng)的小腸各段外翻腸囊中有機(jī)態(tài)錳的吸收率比無機(jī)形態(tài)的錳高。外翻腸囊法因操作簡單、快速、重復(fù)性好、試驗(yàn)條件容易控制而被廣泛應(yīng)用于研究某種營養(yǎng)物質(zhì)的吸收特點(diǎn)，但該方法不能完全模擬動物體內(nèi)腸道的生理特征，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會有一定誤差。

2.2 尤斯灌流法丹麥學(xué)者Ussing等［20］首次利用尤斯灌流（Ussing Chamber）法研究蛙的皮膚上皮組織中Na+離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，隨后Ussing Chamber作為體外模型應(yīng)用于胃腸道內(nèi)藥物的吸收和代謝［21］。Ussing Chamber是根據(jù)電壓鉗原理設(shè)計(jì)出的專門用于研究上皮組織電生理屬性的儀器，主要由2個部分組成，即灌流室和電路系統(tǒng)，另有配套的軟件、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及計(jì)算機(jī)顯示系統(tǒng)。取一段動物腸段去除肌層，置于Ussing Chamber灌流室中，灌流室分為上下兩個小室，通過不同的時間段檢測連于兩室的回路電流或通過同位素來研究營養(yǎng)物質(zhì)在兩室之間跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程。其中兩室內(nèi)溶液的構(gòu)成、濃度以及溫度等都應(yīng)根據(jù)具體需要進(jìn)行控制。

近幾年，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于動物胃腸道營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及胃腸道黏膜屏障功能的研究，主要集中在葡萄糖、小肽、氨基酸以及鈣磷等礦物元素的轉(zhuǎn)運(yùn)方面。Michiels等［22］采用Ussing Chamber方法研究了麝香草酚和反式-肉桂醛對豬空腸Na+依賴性D-葡萄糖、L-丙氨酸的吸收和Cl-的分泌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)麝香草酚和反式-肉桂醛對空腸葡萄糖和氨基酸的吸收呈劑量依賴性，1 mmol/L的反式-肉桂醛顯著減少葡萄糖和氨基酸的吸收率。Awad等［2］采用Ussing Chamber方法研究飼喂菊糖后的仔豬葡萄糖穿過空腸中段的電生理轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)果表明，菊糖可能通過增加斷奶仔豬空腸粘膜的通透性，改變腸黏膜屏障功能，從而提高葡萄糖的吸收。不同品種動物胃腸道吸收礦物質(zhì)的機(jī)制存在顯著差異，大量研究采用Ussing Chamber方法研究礦物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收。Wilkens等［23］采用Ussing Chamber系統(tǒng)比較研究了山羊和綿羊小腸Ca2+的吸收機(jī)制的差異。研究表明，與綿羊相比，山羊?qū)Φ外}食物的適應(yīng)能力較強(qiáng)，而這種適應(yīng)能力主要受激素的調(diào)節(jié)增加小腸鈣的吸收，特別是在空腸，以彌補(bǔ)低鈣飲食的供給，而山羊瘤胃鈣轉(zhuǎn)運(yùn)既不受日糧鈣濃度的影響，也不受鈣三醇的調(diào)節(jié)。而研究者［24］采用Ussing Chamber方法研究低鈣飲食引起山羊而不是綿羊血漿中鈣三醇濃度升高并且引起瘤胃鈣吸收增加。對于以上研究差異的原因需要進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí)。

以上研究表明，Ussing Chamber法已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于胃腸道上皮組織的通透性和離子轉(zhuǎn)運(yùn)，并且也應(yīng)用于不同化合物的吸收機(jī)制，用來評價不同營養(yǎng)物質(zhì)間的相互作用。然而，這種方法不適用于對兔腸道上皮細(xì)胞養(yǎng)分的轉(zhuǎn)運(yùn)的研究，因?yàn)橥檬改c和空腸組織太厚，不適用于Ussing Chamber系統(tǒng)離子擴(kuò)散［25］。

2.3 刷狀緣膜囊法刷狀緣膜囊（BBMV）是通過一定方法來提取腸上皮細(xì)胞頂膜，然后在特定緩沖液中重新環(huán)化為球狀的膜囊，在膜囊表面均勻分布著一些營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，如Na+葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體及肽類轉(zhuǎn)運(yùn)載體等，利用分離的BBMVs可以研究由載體介導(dǎo)的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)。此方法是研究轉(zhuǎn)運(yùn)載體動力學(xué)特性常用的方法，由于刷狀緣膜囊（BBMV）存在大量的活性細(xì)胞膜載體，因此保留了足夠有效的轉(zhuǎn)運(yùn)活性［26］；而且BBMV模型還能避免細(xì)胞代謝、底物呈遞、細(xì)胞滲透壓等的影響，所以測量值相對更為精確。目前，較常用分離BBMV的方法是CaCl2和MgCl2沉淀法［27］。黃騫［28］利用Ca2+沉淀法獲取了純化的BBMV，來研究谷氨酰胺、葡萄糖在刷狀緣膜的轉(zhuǎn)運(yùn)及載體表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)低灌流組腸刷狀緣Na+依賴性葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)及其載體表達(dá)明顯下降，而谷氨酰胺則未見明顯變化。肖英平等［29］研究表明，谷氨酰胺通過提高斷奶仔豬空腸刷狀緣膜堿性磷酸酶活性及調(diào)控腸道健康因子的表達(dá)來提高仔豬的生產(chǎn)性能。國內(nèi)外研究多采用BBMV法研究小腸葡萄糖的吸收能力［30，4］，Woodward等［31］采用BBMV法比較研究了馬和豬的腸道葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，表明馬的空腸D-葡萄糖的吸收能力比豬低。目前，還有較多的應(yīng)用BBMV法進(jìn)行糖尿病的發(fā)病機(jī)理的研究。

2.4 體外細(xì)胞模型小腸上皮細(xì)胞（Intestine Epithelium Cells，IEC）參與了腸道的消化、吸收、內(nèi)外分泌及免疫屏障等功能。目前，培養(yǎng)動物和人的腸上皮細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)及分子細(xì)胞學(xué)研究。體外分離培養(yǎng)小腸上皮細(xì)胞對于研究腸道內(nèi)細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及IEC增殖和分化機(jī)制等方面具有重要意義［3］。

體外細(xì)胞模型為研究多種營養(yǎng)素在小腸的吸收機(jī)制提供了一個有效且易于操作的實(shí)驗(yàn)手段。近十幾年來，國內(nèi)外已普遍采用組織細(xì)胞模型來研究營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，包括Caco-2細(xì)胞單層模型、Caco-2/ HT29-H細(xì)胞共培養(yǎng)模型及IPEC細(xì)胞模型等。其中尤其是Caco-2細(xì)胞模型以其與人體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)研究的良好相關(guān)性，被普遍應(yīng)用于腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收研究［32，1］。同時，國內(nèi)外也采用組織塊和酶消化法原代分離培養(yǎng)不同種屬動物小腸上皮細(xì)胞研究動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用［33-34］。相振田［35］采用體外分離培養(yǎng)的豬小腸上皮細(xì)胞為模型，研究不同淀粉體外酶解產(chǎn)物對豬腸上皮細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼喂高直鏈淀粉和支鏈淀粉比例的豌豆淀粉增加小腸上皮細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體SGLT1和GLUT2基因的表達(dá)，從而增加腸道內(nèi)葡萄糖的吸收利用率，有利于仔豬腸道的健康。Wasa等［36］采用體外培養(yǎng)的腸上皮細(xì)胞株研究谷氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺等氨基酸營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)運(yùn)速率下降，并推測這可能是由于細(xì)胞膜上活性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)單位表達(dá)下降引起的。

胃腸道pH值和胃腸道的酶類直接影響營養(yǎng)物質(zhì)吸收，因此，采用體外模擬消化與細(xì)胞模型相結(jié)合，進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的研究，模擬營養(yǎng)物質(zhì)吸收的生理環(huán)境，可以更準(zhǔn)確地預(yù)測某種養(yǎng)分在體內(nèi)的生物利用度。Yun等［37］也利用體外模擬消化與Caco-2細(xì)胞相結(jié)合研究提高了鐵的生物利用度，與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有很好的相關(guān)性，證實(shí)了這一模型的可行性。與實(shí)驗(yàn)動物相比，體外細(xì)胞模型比飼養(yǎng)動物更經(jīng)濟(jì)省時，且干擾因素較少，試驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性較好。

3 小結(jié)

綜上所述，采用在體及體外研究方法對營養(yǎng)物質(zhì)吸收進(jìn)行研究已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，這樣可以定性、定量地研究營養(yǎng)物質(zhì)在腸道的吸收動力學(xué)、吸收機(jī)制、有效吸收部位及影響吸收的因素等信息，為某種營養(yǎng)物質(zhì)的高效利用、減少飼料資源的浪費(fèi)提供更科學(xué)的理論依據(jù)。

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Advance in Study Methods on Nutrients Absorption in Animal Intestine

LIU Fei-fei1,2,QIN Gui-xin1,2*,SUN Ze-wei1,WANG Tao1,YU Wen-ya1,2, ZHANG Lin1,2,SUN Zhe3,YUAN Zhi-jie1,2
（1.College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China；2.Key Laboratory of Animal Production,Product Quality and Security,Ministry of Education,Jilin Agricultural University, Tilin Changchun 130118,China；3.College of Life Science,Jilin Agricultural University,Tilin Changchun 130118,China）

The intestine is the main site of nutrients absorption.Th e digestion and absorption in the intestine had been recognized as critical factors in determining the efficient utilization of nutrients.The methods of intestinal absorption could show that absorption sites,absorption efficiency,absorption mechanism and the absorption kinetics parameters in the intestine.Various methods of studying nutrients absorption main including in situ（vessel catheter and intestinal perfusion）,and in vitro（everted gut sac,BBMVs,ussing chamber and cell models）were reviewed in this paper,which should offer the references for the study of nutrients absorption.

intestine；methods of nutrient absorption；vessel catheter；intestinal perfusion；everted gut sac；cell models

S814.2

A

0258-7033（2015）09-0081-05

2014-09-22；

2014-11-17

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2013CB127306）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目，（31072037）

劉飛飛（1985-），女，吉林長春人，博士生，主要從事動物營養(yǎng)學(xué)研究，E-mail：feikathy@163.com

*通訊作者：秦貴信，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：qgx@jlau.edu.cn