胡　玥，陶麗媛，呂　賓(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，浙江杭州310006)

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蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3——疾病治療的新靶點(diǎn)*

胡玥，陶麗媛，呂賓△
(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科，浙江杭州310006)

PDIA3: a new therapeutic target of diseases

HU Yue，TAO Li-yuan，LBin
(Department of Gastroenterology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310006，China.E-mail: lvbin@ medmail.com.cn)

［ABSTRACT］Protein disulfide isomerase A3 (PDIA3) is a member of protein disulphide isomerase family and widely exists in endoplasmic reticulum，cell surface，nucleus and mitochondria.PDIA3 promotes the glycoprotein folding and quality control in the endoplasmic reticulum and is also a key molecular of major histocompatibility complex class I molecules assembly.In addition，PDIA3 is involved in the cell signal transduction and plays an important role in a variety of disease development.Therefore，this paper talks about the function of PDIA3，the relationship between disease and PDIA3 as well as its clinical outlook.

［關(guān)鍵詞］蛋白二硫鍵異構(gòu)酶A3

［KEY WORDS］Protein disulfide isomerase A3

［修回日期］2015-04-03

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3 (protein disulfide isomerase A3，PDIA3 )，又稱ERp57或ERp57/GRP58，是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)家族的一員，具有催化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)二硫鍵形成、氧化還原及異構(gòu)化的作用。Bennett等［1］于1988年首次從不同物種中分離出PDIA3基因的互補(bǔ)DNA編碼鏈，諸多研究顯示其氨基酸序列與PDI有高度相似性，具有PDI活性，遂將其歸為PDI家族。

PDIA3蛋白由位于15號(hào)染色體上的PDIA3基因編碼而成，結(jié)構(gòu)存在高度復(fù)雜性，由505個(gè)氨基酸構(gòu)成，最初的24個(gè)氨基酸構(gòu)成了信號(hào)肽;蛋白分子量為58 kD，由4個(gè)硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，分別稱為a、b、b’和a’，與硫氧還蛋白相似，有特有的α螺旋和β折疊［2］。

人類(lèi)PDIA3的mRNA在肝、肺、胎盤(pán)、胰腺和腎臟中表達(dá)最高，在心臟、骨骼肌和大腦中表達(dá)最低，表達(dá)量的高低存在動(dòng)態(tài)變化，如骨髓間充干細(xì)胞中的PDIA3基因表達(dá)量隨著細(xì)胞衰老而下降［3］。PDIA3主要分布于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)腔，也因此獲得別名ERp57，但其在細(xì)胞表面、細(xì)胞核和線粒體等不同部位也廣泛存在，各自發(fā)揮不同的作用。

1 PDIA3的功能

1.1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的作用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是PDIA3發(fā)揮作用最重要的場(chǎng)所。作為重要的分子伴侶，PDIA3和鈣聯(lián)接蛋白、鈣網(wǎng)蛋白組成復(fù)合物共同促進(jìn)細(xì)胞新合成的糖蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中正確折疊，并進(jìn)行質(zhì)量控制。使用小干擾RNA干預(yù)成纖維細(xì)胞中PDIA3的表達(dá)，可影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生糖蛋白翻譯后折疊［4］。同時(shí)，PDIA3參與主要組織相容性(抗原)復(fù)合物I (major histocompability complex I，MHC I)類(lèi)分子的組裝，以二聚體的形式與MHCI重鏈、β2-微球蛋白、鈣網(wǎng)蛋白、抗原轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白等一起組成肽加載復(fù)合物(peptide-loading complex，PLC)，使抗原結(jié)合溝槽更適合抗原肽，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答的內(nèi)源性抗原提呈中發(fā)揮重要作用。Garbi等［5］對(duì)小鼠B細(xì)胞進(jìn)行PDIA3基因敲除，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞的發(fā)育、增殖以及抗體的分泌均未受影響，但出現(xiàn)PLC的組裝異常，影響抗原提呈。另外，蛋白質(zhì)組學(xué)分析提示包括PDIA3在內(nèi)的多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白是吞噬體的組成成分，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞的吞噬作用［6］，可見(jiàn)PDIA3亦是固有免疫的重要參與者。Schelhaas等［7］指出，當(dāng)完整猿猴病毒從細(xì)胞表面通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，衣殼蛋白被PDIA3解離，釋放入細(xì)胞質(zhì)，繼而進(jìn)入細(xì)胞核。

大量研究發(fā)現(xiàn)，多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)多種應(yīng)激蛋白上調(diào)，這種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激現(xiàn)象與急性肺損傷、纖維增生性急性呼吸窘迫綜合癥、H1N1導(dǎo)致的慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)急性加重密切相關(guān)。PDIA3作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的氧化還原酶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)程中發(fā)生上調(diào)。甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激，上調(diào)PDIA3，而PDIA3的減少會(huì)降低病毒的侵害，降低caspase-12的激活和上皮細(xì)胞的凋亡［8］。而代謝綜合征患者餐后脂肪組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以平衡進(jìn)餐引起的應(yīng)激［9］。

1.2在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外的作用Hirano等［10］首次觀察到3T3細(xì)胞分泌PDIA3，隨后的研究證實(shí)PDIA3存在于多種細(xì)胞表面或細(xì)胞膜蛋白復(fù)合物中。PDIA3和維生素D受體相互依存，和微囊蛋白1共同定位于MC3T3-E1成骨細(xì)胞，共同介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)于1α，25 (OH)2D3的反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能［11］。PDIA3有核定位信號(hào)序列(nuclear location sequence，NLS)，能從細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)入細(xì)胞核，改變靶基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2進(jìn)行TNF-α干預(yù)后，細(xì)胞質(zhì)中的PDIA3在15 min內(nèi)移位到細(xì)胞核［12］。細(xì)胞核中的PDIA3與DNA和核蛋白相聯(lián)，Aureli等［13］在HeLa細(xì)胞株和黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有相同的DNA序列，能在應(yīng)激反應(yīng)時(shí)與PDIA3特異性結(jié)合，而通過(guò)RNA干擾使PDIA3基因沉默后，此段DNA序列表達(dá)下調(diào)，提示PDIA3可能調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄和DNA的修復(fù)。線粒體中的PDIA3能保護(hù)線粒體鈣蛋白酶，抵抗其它線粒體蛋白酶對(duì)其降解;同時(shí)，PDIA3與鈣蛋白酶的復(fù)合物能催化凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)的部分降解，使之從線粒體膜釋放入細(xì)胞質(zhì)，從而參與凋亡過(guò)程［14］。

綜上所述，PDIA3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過(guò)各種途徑參與蛋白質(zhì)的加工處理、MHCI類(lèi)分子的組裝、固有免疫應(yīng)答、適應(yīng)性免疫應(yīng)答的抗原提呈，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過(guò)程。而其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外，廣泛分布于多種細(xì)胞表面及細(xì)胞膜蛋白復(fù)合物，則能參與調(diào)節(jié)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能;進(jìn)入細(xì)胞核后參與靶基因轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù);線粒體中的PDIA3能對(duì)抗線粒體降解，參與細(xì)胞凋亡。PDIA3通過(guò)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)外的各種功能共同介導(dǎo)了眾多疾病的發(fā)生與發(fā)展。

2 PDIA3相關(guān)疾病

2.1腸易激綜合征PDIA3在腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)中表達(dá)上調(diào)。應(yīng)用差異熒光雙向凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行IBS大鼠結(jié)腸差異蛋白篩選，發(fā)現(xiàn)19個(gè)差異蛋白點(diǎn)，并對(duì)篩選出的差異蛋白進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)IBS大鼠結(jié)腸黏膜組織中PDIA3蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組［15］。我們前期研究［16］用Western-blot檢測(cè)15例腹瀉型IBS(IBS-D)患者結(jié)腸黏膜組織中PDIA3蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)顯著高于健康對(duì)照組，同時(shí)，檢測(cè)到IBS-D患者結(jié)腸組織中的類(lèi)胰蛋白酶濃度明顯高于對(duì)照組，且PDIA3與類(lèi)胰蛋白酶濃度呈正相關(guān)。PDIA3極有可能在IBS的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

2.2肝臟疾病PDIA3在不同肝臟疾病中表現(xiàn)出不同的變化。因長(zhǎng)期酗酒導(dǎo)致肝損傷的患者，其PDIA3表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊異常，引發(fā)肝毒性，是酒精性肝損傷的分子標(biāo)志［17］。而在非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)患者的肝活檢組織中，以及游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)誘導(dǎo)的脂肪肝細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)PDIA3蛋白表達(dá)上調(diào)，PDIA3的表達(dá)與NAFLD患者的炎癥程度和纖維化程度有關(guān);用siRNA干擾脂肪細(xì)胞中PDIA3的表達(dá)能顯著減少脂肪堆積，提示PDIA3可能通過(guò)影響脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝參與NAFLD發(fā)?。?8］。

2.3氣道高敏感PDIA3在氣道過(guò)敏性疾病中起顯著作用。采用屋塵螨作為變應(yīng)原在體外和體內(nèi)對(duì)人類(lèi)與小鼠的氣道初級(jí)上皮細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)激，可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激活轉(zhuǎn)錄因子α6(activating transcription factor α6，ATF6α)以及PDIA3，關(guān)聯(lián)性激活caspase-3;而對(duì)ATF6α和PDIA3基因敲除小鼠進(jìn)行屋塵螨刺激，則可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少二硫鍵介導(dǎo)的寡聚化和caspase-3的激活;同時(shí)，炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道纖維化的發(fā)生率也相應(yīng)降低。所以，PDIA3在屋塵螨誘導(dǎo)的氣道過(guò)敏性疾病中發(fā)揮了重要作用，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可能為慢性哮喘和與肺功能喪失相關(guān)性上皮間質(zhì)化提供一個(gè)潛在的治療途徑［19］。

2.4腎臟疾病PDIA3與腎臟纖維化有關(guān)。腎臟細(xì)胞在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factorβ1，TGFβ1)、血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)或血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)刺激下，引起保護(hù)性的未折疊蛋白效應(yīng)通路激活，從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激效應(yīng)，并分泌大量的PDIA3，引起細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的分泌和積聚而造成腎纖維化。無(wú)論是患者組織活檢及動(dòng)物模型，均提示腎纖維化與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激這兩者的程度和PDIA3的分泌量呈正相關(guān)。若敲除PDIA3基因或使用抗PDIA3抗體，則能破壞細(xì)胞外基質(zhì)的纖維化進(jìn)程。另外，有研究發(fā)現(xiàn)PDIA3在慢性腎臟病的早期就有分泌，而它在小便中的含量高低也與腎纖維化的程度呈線性相關(guān)，所以PDIA3有可能是腎纖維化發(fā)生與發(fā)展的標(biāo)志之一［20］。

研究顯示在腎移植發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)，PDIA3在血清和移植腎中的基因和蛋白表達(dá)水平均升高，并伴隨著血漿中IL-2、IL-4、IL-6和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)水平的升高，提示PDIA3可能參與腎移植急性排斥反應(yīng)，而升高的IL-2、IL-4、IL-6 和CRP起保護(hù)性作用［21］。

2.5血小板聚集與血栓形成血小板中的PDIA3能調(diào)節(jié)血小板的聚集。使用PDIA3的拮抗劑，或給小鼠注入非活化的PDIA3，發(fā)現(xiàn)其尾靜脈出血時(shí)間延長(zhǎng)，血小板聚集欠佳，αIIbβ和P選擇素的表達(dá)受到抑制，可抑制血栓形成［22］。Wang等［23］發(fā)現(xiàn)PDIA3基因敲除小鼠的血小板數(shù)量和血小板糖蛋白表達(dá)沒(méi)有變化，但尾靜脈出血時(shí)間延長(zhǎng)，頸動(dòng)脈損傷后的血栓閉塞時(shí)間也延長(zhǎng)。而采用腸系膜動(dòng)脈血栓的模型，發(fā)現(xiàn)PDIA3基因敲除血小板聚集欠佳，激活整合素αIIbβ3能力欠缺，參與血栓形成的比例降低，導(dǎo)致血栓形成緩慢，于添加外源性的PDIA3后，血小板聚集缺陷能得到改善。

2.6腫瘤PDIA3調(diào)控STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與增殖，與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。宮頸癌患者腫瘤組織與宮頸上皮內(nèi)瘤變組織或正常組織相比，PDIA3的mRNA和蛋白表達(dá)均降低，而PDIA3的表達(dá)高低和總體生存率的高低呈正相關(guān)，提示PDIA3可能是宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，改善PDIA3水平或可成為宮頸癌的治療手段［24］。

上皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)是一種酪氨酸激酶受體，能激活許多信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Gaucci等［25］發(fā)現(xiàn)敲除乳腺癌細(xì)胞的PDIA3基因后，該細(xì)胞的EGFR表達(dá)、在細(xì)胞膜上的分布以及與EGF的結(jié)合都未發(fā)生改變，但是其磷酸化和內(nèi)在化受到影響，提示PDIA3可通過(guò)影響EGFR的活化間接調(diào)控腫瘤的發(fā)生。

在哈薩克族食管鱗狀細(xì)胞癌患者中，PDIA3的表達(dá)較正常人群下降52%，且下降的程度與腫瘤分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵犯深度相關(guān)［26］。同時(shí)，PDIA3還與膽囊癌患者的腫瘤進(jìn)展與臨床表現(xiàn)有關(guān)，是潛在的診斷與判斷預(yù)后的生物標(biāo)記［27］。另外，有研究表明PDIA3能調(diào)節(jié)人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞化療的敏感性，有望成為新的化療分子靶點(diǎn)［28］。

2.7神經(jīng)退行性病變阿爾茨海默氏癥的發(fā)病歸因于β-淀粉肽的沉積導(dǎo)致的神經(jīng)毒性。正常情況下，腦脊液中的β-淀粉肽與PDIA3和鈣網(wǎng)蛋白作為復(fù)合物存在，受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的翻譯后加工系統(tǒng)催化，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的催化及加工能力隨著年齡的增長(zhǎng)而減弱，使得β-淀粉肽不能形成復(fù)合物而發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致相應(yīng)疾病的發(fā)生。

5-S-半胱氨酰多巴胺(5-S-cysteinyldopamine，CysDA)參與帕金森神經(jīng)退行性病變，主要是由于其能誘導(dǎo)大量的氧化應(yīng)激和蛋白聚集有關(guān)，而其中最重要的是PDIA3表達(dá)上調(diào)，這在帕金森模型小鼠和細(xì)胞中得到了印證［29］。

2.8生殖在人類(lèi)精子發(fā)生過(guò)程中，PDIA3存在于精母細(xì)胞、精子和人睪丸的Leydig細(xì)胞胞質(zhì)中，在Sertoli細(xì)胞中也有少量表達(dá)，而精子頂體內(nèi)的PDIA3則是精卵融合所需的［30］。國(guó)內(nèi)學(xué)者在大鼠的精母細(xì)胞和精子［31］中也發(fā)現(xiàn)有PDIA3的分布，同樣表明其在精卵融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。另外，PDIA3或許能成為男性不育的一個(gè)新的表型標(biāo)記，并可以用于體外受精精子的選擇。

3研究展望

如上所述，PDIA3與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，是一種有效的干預(yù)中介，針對(duì)它的治療成為當(dāng)下臨床應(yīng)用新的突破點(diǎn)。近年來(lái)，關(guān)于PDI為治療靶點(diǎn)的研究逐漸增多［32］，特別是抑制PDI活性的藥物的研發(fā)，目前相應(yīng)的藥物主要有抗生素、巰基阻斷劑、砷化合物、雌激素化合物及天然或人工合成的小分子化合物等，這些化合物大部分是通過(guò)不可逆性抑制PDI活性位點(diǎn)半胱氨酸來(lái)發(fā)揮作用，但藥物數(shù)量有限，且缺乏選擇性及有效性，并有顯著的非靶向毒性，使得特異性抑制PDI活性成為目前藥物研究的難點(diǎn)。而PDIA3作為PDI家族一員，已被證明能夠被人工合成的丙炔酸氨基甲酰甲基酰胺16F16 (3)靶向抑制［33］，同時(shí)萬(wàn)古霉素能影響PDIA3與鈣網(wǎng)蛋白間的相互作用，使構(gòu)象發(fā)生變化，降低復(fù)合物的穩(wěn)固性而發(fā)揮作用［34］。天然植物代謝產(chǎn)物Juniferdin［35］和槲皮素-3-蕓香糖甙被證明對(duì)PDIA3無(wú)明顯抑制作用［36］。另外，Trnková等［37］發(fā)現(xiàn)綠茶酚能輕度抑制PDIA3的還原酶活性，預(yù)防多種疾病的發(fā)生，起到保健作用。相關(guān)特異性抑制劑的研制和發(fā)展遭遇挑戰(zhàn)的一個(gè)重要原因是PDI結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性，有效抑制PDI的影響因素和機(jī)制未完全明了，而PDI抑制劑對(duì)PDIA3活性的影響則仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前已能利用生物工程技術(shù)生產(chǎn)人類(lèi)PDIA3蛋白。酵母細(xì)胞是生產(chǎn)人類(lèi)PDIA3蛋白的優(yōu)良宿主，能識(shí)別和加工人類(lèi)PDIA3蛋白的天然信號(hào)肽，分泌重組PDIA3蛋白，該蛋白擁有天然蛋白的氨基酸序列和生物活性，經(jīng)過(guò)純化后能達(dá)到10 mg/L，能為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)外的PDIA3生物學(xué)功能及進(jìn)行生物學(xué)治療提供便利［38］。

4結(jié)語(yǔ)

現(xiàn)有研究表明PDIA3與多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，檢測(cè)或干預(yù)相關(guān)部位的PDIA3表達(dá)水平，可能成為疾病早期診斷與治療的新靶點(diǎn)。目前，關(guān)于PDIA3的認(rèn)識(shí)尚未完全明了，還有待進(jìn)一步研究，如對(duì)PDIA3生物學(xué)功能深入探討則可促進(jìn)對(duì)相關(guān)疾病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，而研究各個(gè)相關(guān)疾病中PDIA3的變化將有助于對(duì)其有一個(gè)更全面的認(rèn)識(shí)。PDIA3是疾病發(fā)生發(fā)展的反應(yīng)性變化，亦或是導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的主導(dǎo)原因仍值得深入發(fā)掘，同時(shí)，基因干預(yù)將成為主要手段，以深化PDIA3治療作用的研究。

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·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

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*［基金項(xiàng)目］國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81170348) ;浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.LZ12H03001) ;高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(No.722212A001)

［收稿日期］2015-02-15

［文章編號(hào)］1000-4718(2015)06-1145-05

［中圖分類(lèi)號(hào)］R363

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.06.032