胡 貞

(廣東省龍川縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣東龍川 517300)

PCR技術(shù)及其在禽流感診斷中的應(yīng)用

胡 貞

(廣東省龍川縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,廣東龍川 517300)

目的:分析PCR技術(shù)原理并探討其在禽流感診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法:回顧分析近幾年P(guān)CR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)在禽病中的應(yīng)用研究資料，并對(duì)該技術(shù)的特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)。結(jié)果:PCR技術(shù)具有比較好的靈敏性、特異性等優(yōu)點(diǎn)，操作十分迅速便利。既可單獨(dú)運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)中，還可同其他技術(shù)相配合，其應(yīng)用對(duì)象比較廣泛，幾乎覆蓋了所有生物，在DNA檢測(cè)和RNA擴(kuò)增檢測(cè)中同樣適用。結(jié)論:PCR技術(shù)在禽流感診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)禽流感病毒檢測(cè)十分靈敏準(zhǔn)確，可在實(shí)際診斷過程中予以利用和推廣。

PCR技術(shù) 禽流感 診斷 應(yīng)用

PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是美國(guó)Getus在1985年發(fā)明的一種基于DNA變性與復(fù)性原理，高效擴(kuò)增體外特定DNA片段的技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)的主要特征是敏感性和特異性均高于傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法，操作較為簡(jiǎn)便，同時(shí)又快速高效，在生物學(xué)基因鑒定、實(shí)驗(yàn)、檢測(cè)等方面可以均加以利用[1]。此外，該技術(shù)還可應(yīng)用在臨床樣品檢驗(yàn)中，成為臨床診斷的重要參考依據(jù)之一。本文在分析PCR技術(shù)原理的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)研究了其發(fā)展概況和臨床應(yīng)用現(xiàn)狀。

1 PCR技術(shù)基本原理

PCR（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是通過體外酶的合成作用，形成具有特異性DNA片段的一種新技術(shù)，發(fā)展于20世紀(jì)80年代，屬于體外核酸擴(kuò)增新技術(shù)。該技術(shù)基本原理分別涉及3個(gè)基礎(chǔ)反應(yīng)程序，即變性程序、退火程序和延伸程序，3個(gè)程序經(jīng)多次循環(huán)交替作用，逐漸將DNA片段擴(kuò)增到幾百萬倍，使得大量“半保留復(fù)制鏈”進(jìn)一步增多，新鏈又作為下一次的循環(huán)模板得以延續(xù)。在95℃高溫下，靶DNA雙鏈經(jīng)受熱變性程序后裂解成為兩條單鏈模板，而后在37～55℃條件下，兩條寡后核苷酸引物同與其互補(bǔ)的單鏈模板相結(jié)合，構(gòu)成部分雙鏈，其次在DNA聚合酶72℃最適溫度下，將引物分端作為合成起點(diǎn)，4種DNTP作為合成原料，從模板5′向3′延伸，實(shí)現(xiàn)DNA新鏈的合成[2]。理論分析表明，反應(yīng)程序每循環(huán)一次時(shí)長(zhǎng)大致為2～4min，大概2～3h就可以把基因擴(kuò)大百萬倍，整個(gè)反應(yīng)過程在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就可完成，經(jīng)反復(fù)循環(huán)后目的基因大約能夠擴(kuò)增億倍。此后可以運(yùn)用序列分析或探針雜交手段來檢測(cè)分析基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。

大量科學(xué)實(shí)驗(yàn)及研究表明，PCR技術(shù)具有比較好的靈敏性、特異性等優(yōu)點(diǎn)，其擴(kuò)增模板的理論值可達(dá)到一個(gè)分子，目前有學(xué)者Crescenzit等證明了PCR技術(shù)在癌癥染色體轉(zhuǎn)位檢測(cè)過程中的靈敏度大約可達(dá)到 10-5～10-6；而PCR在擴(kuò)增過程中只針對(duì)同引物序列相互補(bǔ)的模板，因此該項(xiàng)技術(shù)的特異性較優(yōu)。

2 PCR技術(shù)發(fā)展概況

作為一種應(yīng)用范圍廣的多元檢測(cè)技術(shù)，PCR技術(shù)一直受到學(xué)者的重視，隨著該技術(shù)的深入研究，傳統(tǒng)的PCR技術(shù)得到不斷改進(jìn)，并呈現(xiàn)出不斷發(fā)展變化的特點(diǎn)。現(xiàn)將主要的PCR技術(shù)延伸類型闡述如下。

2.1 反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)

反轉(zhuǎn)錄PCR（即RT-PCR）屬于DNA體外擴(kuò)增技術(shù)的一種，在檢測(cè)豐度低的特異性RNA方面有著較高價(jià)值。該項(xiàng)反應(yīng)包括兩個(gè)步驟，即單引物介導(dǎo)與反轉(zhuǎn)錄酶催化共同發(fā)揮作用合成RNA互補(bǔ)鏈，在加熱條件下RNA互補(bǔ)鏈同RNA鏈解離后同另外一引物退火，聚合酶催化引物經(jīng)延伸形成雙鏈靶 DNA， 最后回歸到傳統(tǒng)的PCR進(jìn)行靶DNA擴(kuò)增。一般理論下，該項(xiàng)新型PCR技術(shù)能夠檢測(cè)到總RNA里低豐度小于1ng的mRNA，在取得并擴(kuò)增特定RNA相互補(bǔ)的RNA互補(bǔ)鏈方面有著重要作用。

2.2 反向PCR技術(shù)

反向PCR是用于擴(kuò)增已知序列兩側(cè)未知數(shù)列的體外擴(kuò)增技術(shù)，通過限制性內(nèi)切酶來消化已知序列，并結(jié)合T4DNA連接酶作用環(huán)化存在黏性末端的未知序列，在上述線狀到環(huán)化及再線狀變化情況下，原來兩側(cè)的未知序列會(huì)置于已知數(shù)列中央，由此PCR擴(kuò)增技術(shù)可以對(duì)未知數(shù)列進(jìn)行測(cè)定。該種方法對(duì)于研究轉(zhuǎn)位因子、基因游走以及已知序列DNA兩側(cè)病毒的整合點(diǎn)位研究具有重要意義。

2.3 半套式PCR

在半套式PCR技術(shù)第2次基礎(chǔ)反應(yīng)中，2個(gè)引物和第1次基礎(chǔ)反應(yīng)里的1個(gè)引物是完全相同的，通過內(nèi)外2對(duì)引物的先后2次擴(kuò)增，能夠在微量模板里獲取更高濃度及純度的DNA目的片段，其敏感性較之常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)更優(yōu)，在臨床樣品、病毒感染檢測(cè)中價(jià)值突出。

2.4 二溫式PCR

二溫式PCR其變性溫度、退火溫度及延伸溫度只存在2種溫度變化，較之傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，其操作環(huán)節(jié)更為簡(jiǎn)潔，實(shí)現(xiàn)了較快的擴(kuò)增速度，為臨床樣品檢測(cè)節(jié)約了時(shí)間。與多重PCR技術(shù)相結(jié)合，形成了二溫多重PCR技術(shù)，該項(xiàng)技術(shù)綜合了兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，一方面將PCR反應(yīng)擴(kuò)增時(shí)的退火溫度與延伸溫度進(jìn)行合并，成為同一個(gè)溫度；另一方面使得同一檢測(cè)體系能夠檢測(cè)出多種病原，是一種簡(jiǎn)單高效的PCR擴(kuò)展技術(shù)。

3 PCR技術(shù)在禽流感診斷中的實(shí)際應(yīng)用

禽流感是多發(fā)于禽類中的一種病毒性傳染病，主要由正黏病毒科A型流感病毒（即AIV）所引起，現(xiàn)已被WTO和OIE列為A類重大傳染疾病，目前該疾病在世界范圍內(nèi)均有分布，給家禽業(yè)發(fā)展造成了極大的影響。

針對(duì)禽流感病毒（即AIV），傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要進(jìn)行較長(zhǎng)周期的分離鑒定試驗(yàn)，還需進(jìn)行野外取材，其他病毒混入的概率大大增加，其診斷結(jié)果往往不夠準(zhǔn)確，甚至出現(xiàn)誤診情況。反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)主要從基因水平的角度進(jìn)行AIV檢測(cè)，其診斷將H亞型相同N亞型不同的HA基因保守序列作為靶序列，通過特異性引物和AIV病毒RNA、反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、凝膠電泳提取，預(yù)期條帶回收及測(cè)序，最終進(jìn)行定性判斷。該種方法的敏感性、特異性較好，克服了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)，應(yīng)用在早期的禽流感診斷中，具有便捷、使用、敏銳等優(yōu)勢(shì)。

套式反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（即巢式反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)）是在設(shè)計(jì)2對(duì)引物后，進(jìn)行不同程度的片段擴(kuò)張。其中1對(duì)引物進(jìn)行稍長(zhǎng)的片段擴(kuò)增，在此擴(kuò)增范圍內(nèi)設(shè)計(jì)另1對(duì)引物，將先設(shè)計(jì)的第1對(duì)引物產(chǎn)物作為最后所擴(kuò)增產(chǎn)物的模板。目前有研究人員參照了基因庫(kù)中典型禽流感病毒的基因序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，構(gòu)建了適用于快速檢測(cè)AIV的套式反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)方法，分別對(duì)不同血清類型的禽類進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中的禽類均可擴(kuò)增出具有特異性的陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其檢測(cè)的敏感程度較高。

熒光PCR技術(shù)在基礎(chǔ)PCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)上匯聚了DNA雜交特異性及敏感性、光譜技術(shù)精準(zhǔn)定量等優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了PCR技術(shù)與光譜、計(jì)算機(jī)技術(shù)的全面有機(jī)融合。該項(xiàng)技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)PCR基礎(chǔ)反應(yīng)中每個(gè)循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號(hào)，隨基礎(chǔ)反應(yīng)的推進(jìn)而實(shí)現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物累計(jì)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度呈現(xiàn)等比例增加的特點(diǎn)，可作為起始模板定量、定性分析的重要依據(jù)[3]。目前有研究者建立了熒光PCR法對(duì)AIV H5進(jìn)行檢測(cè)，得出敏感性達(dá)到了10-7。另有實(shí)際應(yīng)用研究表明通用型的熒光PCR技術(shù)可檢測(cè)AIV 的多種亞型，在引物檢測(cè)過程中還檢出其他常見禽類病毒，同時(shí)不存在交叉反應(yīng)。

4 結(jié)束語(yǔ)

目前禽流感診斷中最常運(yùn)用的是通用型反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，此外由于多重PCR技術(shù)可檢測(cè)出同一系統(tǒng)中的多個(gè)亞型，該項(xiàng)技術(shù)也受到廣泛重視。隨著該項(xiàng)技術(shù)的研究工作的全面開展，未來PCR技術(shù)在動(dòng)物疫病的診斷過程中將會(huì)得到更加廣泛地應(yīng)用，為防治動(dòng)物疫病發(fā)揮重要作用。

[1] 張洪濤.PCR及其相關(guān)技術(shù)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，12（5）： 151-153.

[2] 朱曉娟，徐德順，陳莉萍，等.依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)在諾如病毒基因檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2015，6（5）：697-699.

[3] 田莉莉，李麗.熒光定量PCR技術(shù)在禽病診斷中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，23（14）： 1-5.