買 佳， 王 靜

·綜述·

常用抗深部真菌感染藥物及真菌對其耐藥機制的研究進展

買 佳， 王 靜

真菌； 抗真菌藥物； 耐藥機制

1 真菌感染的相關背景

醫(yī)療水平的提高，在延長了許多患有嚴重疾病患者壽命的同時也導致患真菌感染性疾病的風險增加，特別是長期中性粒細胞減少、應用糖皮質激素治療、骨髓移植和器官移植的患者真菌感染的概率明顯增加[1]。大量研究表明，侵襲性真菌感染患者病死率超過50%[2-3]。盡管一些抗真菌藥物控制了真菌感染的進展，但是隨著真菌對抗真菌藥物耐藥性的出現(xiàn)以及患者對標準化抗真菌治療的效果不明顯，增加了臨床治療難度，嚴重影響了深部真菌感染患者的預后，促使人們對真菌的耐藥機制進行研究。這需要深入研究宿主的免疫狀況、機體對真菌侵襲的免疫反應、真菌種類、感染真菌的特性、真菌對不同抗真菌藥物的敏感性以及抗真菌藥物的吸收、代謝、毒性等特性及它們之間的相互作用的情況。

臨床上常見的條件致病真菌主要包括：①念珠菌屬，常見致病念珠菌按致病力強弱排序為白念珠菌、熱帶念珠菌、類星形念珠菌、假熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、克魯斯念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌等。②曲霉屬，曲霉能夠產生真菌毒素導致食物中毒；孢子及菌絲導致機體的變態(tài)反應；在肺部感染形成曲霉球等。曲霉作為條件致病真菌主要感染血液病、惡性腫瘤、骨髓移植、慢性肉芽腫和艾滋病(AIDS)患者。③隱球菌屬，新型隱球菌及其變種可以導致人類致病，新型隱球菌病好發(fā)于細胞免疫低下患者, 如惡性腫瘤、AIDS、糖尿病及大劑量使用糖皮質激素患者，但約有半數(shù)患者并無明顯的免疫功能低下疾病。隱球菌主要侵犯中樞神經系統(tǒng)和肺，以中樞神經系統(tǒng)感染最為常見。④毛霉屬，毛霉能夠侵犯全身各個臟器，引起發(fā)病急、進展快、病死率極高的系統(tǒng)性真菌感染。好發(fā)于糖尿病性酸中毒、嚴重燒傷、白血病和淋巴瘤患者。⑤組織胞漿菌屬，組織胞漿菌屬是一種雙相型真菌，其中莢膜組織胞漿菌對人類致病。在有蝙蝠或鳥類的洞穴中易流行組織胞漿菌病, 故又稱該病為“洞穴熱”。組織胞漿菌主要侵犯網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng), 引起肉芽腫性疾病。

2 常用的抗真菌藥物

2.1 多烯類抗真菌藥物

常用的多烯類抗真菌藥物有兩性霉素B (amphotericin B)。其作用的靶位點是真菌細胞膜上的麥角固醇，通過直接結合于真菌細胞膜上的麥角固醇，與麥角固醇相互作用形成甾醇-多烯復合物，在細胞膜上形成許多微孔，使細胞膜對單價和二價陽離子的通透性增加，導致細胞膜內外的離子梯度改變，最終導致真菌死亡[4]。此外，多烯類化合物也具有細胞膜氧化損傷的作用，幾丁質是真菌細胞壁的重要組成部分，性質柔軟，有彈性，可保護真菌不受外環(huán)境有害物質的破壞，高濃度的多烯類化合物可以抑制定位在細胞膜上的幾丁質合成酶，減少幾丁質的合成，破壞真菌的穩(wěn)定性，抑制真菌的生長。由于人的細胞膜含有膽固醇，結構與真菌細胞膜的麥角固醇相似，兩性霉素B能夠與人細胞膜上的膽固醇相互作用，產生藥物的不良反應，當人的腎小球濾過率降低時，可使這種不良反應增加。

2.2 唑類抗真菌藥物

根據(jù)化學結構分為咪唑類和三唑類，現(xiàn)臨床上用得較多的是三唑類抗真菌藥。近年來，這類藥物發(fā)展較快，由第一代三唑類抗真菌藥如氟康唑、伊曲康唑發(fā)展到以泊沙康唑、伏立康唑和雷夫康唑為代表的新上市或處于臨床研究的第二代新三唑類藥物[5]。真菌細胞色素P-450能夠催化羊毛甾醇14位脫α-甲基成為麥角固醇，麥角固醇是真菌細胞膜上的主要成分。唑類藥物通過與細胞色素P-450結合抑制甾醇14α-去甲基酶(CYP51)，導致14α-甲基化甾醇的積累，誘導細胞的通透性發(fā)生變化，破壞細胞膜的滲透性，繼而造成真菌細胞的死亡[6]。唑類抗真菌藥物具有良好的抗真菌譜、藥動學和安全性，在臨床上廣泛應用。

2.3 棘白菌素類抗真菌藥物

臨床常用的棘白菌素類藥物主要有卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈等[7]。棘白菌素類藥物是一種新型抗真菌藥物，其作用機制不同于唑類抗真菌藥物。真菌細胞通過β-1,3-葡聚糖合成酶合成細胞壁的重要多糖組分β-1,3-葡聚糖?？ú捶覂敉ㄟ^非競爭抑制真菌β-1,3-葡聚糖合成酶，抑制細胞壁的β-1,3-葡聚糖合成，破壞真菌細胞壁的結構，達到抑制、殺滅真菌的目的。哺乳動物細胞內并不存在β-1,3-葡聚糖合成酶，棘白菌素類藥物具有特有的選擇性優(yōu)勢。棘白菌素類藥物抗真菌譜廣、毒性低、無交叉耐藥性，對多種念珠菌、地方性真菌、曲霉及卡氏肺孢菌均有效，并且對耐唑類抗真菌藥物的菌株具有較好的抗真菌作用。

2.4 核酸抑制劑類抗真菌藥

常用于抗深部真菌治療的核酸抑制劑類抗真菌藥物有5-氟胞嘧啶(5-FC)。它是一種人工合成的抗真菌藥物，是胸腺嘧啶合成酶的抑制劑，能夠依靠胞嘧啶通透酶的作用進入真菌細胞內，經胞嘧啶脫氨酶轉變成氟尿嘧啶，之后轉變成氟尿苷三磷酸，整合到真菌RNA中去，阻斷蛋白質的合成[8]。氟尿嘧啶還能夠轉變成氟脫氧尿苷-磷酸，競爭性抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，影響DNA的合成，從而抑制真菌細胞的生長。5-FC具有吸收好，毒性小的特點，對血腦屏障有很好的穿透性，腦脊液里濃度高，可以用來治療神經系統(tǒng)的真菌感染。

3 真菌常見的耐藥機制

3.1 對多烯類藥物的耐藥機制

真菌對多烯類抗真菌藥物的耐藥與其細胞膜上的脂質結構改變密切相關。真菌細胞膜上主要甾醇成分改變，被其他甾醇所代替，細胞膜上總麥角固醇含量降低，結合位點的減少，導致兩性霉素B與細胞膜的結合減少[9]，使真菌獲得耐藥性。在體外培養(yǎng)基中誘導出對兩性霉素B低敏感的菌株，發(fā)現(xiàn)誘導后的菌株細胞膜磷脂含量、甾醇/磷脂及不飽和脂肪酸比例均下降，細胞膜流動性增加。另外，真菌細胞壁上的β-1,3-葡聚糖的改變，導致了細胞壁的穩(wěn)定性改變， 兩性霉素B不容易進入細胞內，使真菌獲得耐藥性。有研究認為，使用抑制麥角固醇的生物合成的唑類抗真菌藥物，能導致細胞膜中兩性霉素B的結合位點缺少，使真菌對兩性霉素B產生耐藥性[10]。只使用伊曲康唑的白血病患者體內的白念珠菌出現(xiàn)對伊曲康唑和兩性霉素B均耐藥，其細胞膜中檢測不到麥角固醇。因此，聯(lián)合應用多烯類和唑類抗真菌藥對念珠菌可能會產生拮抗作用，應當注意兩者的使用順序。

3.2 對唑類藥物的耐藥機制

3.2.1 外排泵 真菌外排泵的外排作用導致細胞內藥物積累減少是真菌耐唑類藥物的主要機制。外排泵是真菌的轉運蛋白，鑲嵌在真菌細胞膜上，主要負責將細胞內藥物轉運到細胞外，從而降低了細胞內的藥物濃度，導致對唑類藥物耐藥。真菌外排泵主要包括ABCT超家族(ATP-binding cassette transporters，ABCT)和異化擴散載體超家族。ABCT是一種ATP能量依賴型的多耐藥載體超家族，它有ATP結合區(qū)，通過ATP分解提供的能量將藥物泵出細胞外，進行能量依賴的主動運輸。白念珠菌中ABCT的耐藥相關基因包括CDR(Candidadrug resistance)基因，主要有CDR1和CDR2，合成的 Cdr1p(Candidadrug resistance protein)和Cdr2p是對唑類藥物產生耐藥最主要的ABCT，Cdrp為轉運蛋白，能夠特異性的轉運細胞內的麥角固醇、去甲基化酶和抗真菌藥物，使細胞內抗真菌藥物濃度明顯降低[11]。CDR1過度表達能使菌株對氟康唑、伊曲康唑和特比萘芬都高度耐藥。但CDR1單獨破壞株并未顯示對唑類藥物高度敏感，而CDR1和CDR2同時被破壞的菌株則顯示對唑類藥物的敏感性明顯高于CDR1單獨破壞株[12]。deMicheli等[13]發(fā)現(xiàn)在CDR1的啟動子上有2個調控元件，一個為基礎表達元件，另一個為藥物反應元件，在CDR2的啟動子上只有1個藥物反應元件，2個藥物反應元件都有一個21 bp的相同序列。這一發(fā)現(xiàn)闡明了CDR1與CDR2協(xié)同作用的分子基礎。另一種是非能量依賴型的異化擴散載體超家族(major facilitator super family, MFS)，它們不含有與ATP接合區(qū)，利用細胞內外存在H+離子濃度差，當細胞外的H+離子進入胞內時把藥物泵出細胞，利用電化學勢能進行被動運輸。異化擴散載體超家族的耐藥基因包括MDR1(multidrug resistance)等,其通過基因擴增、轉錄水平升高、mRNA分解速度下降等方式使mRNA過度表達，翻譯出相應的蛋白，介導耐藥性的產生[14]。

忘了忘了。她手忙腳亂合上蓋子。我只顧著吃草莓了。她帶著哭腔。謝謝公司，我以后會加倍努力的！Everything in touch，不會辜負公司對我的期望的！

3.2.2 藥物作用的靶酶改變 唑類藥物的靶酶為ERG11基因編碼的14α-去甲基化酶(CYP51)。ERG11基因突變導致Erg11p的氨基酸序列發(fā)生改變，進一步使14α-去甲基化酶的空間結構發(fā)生改變，酶分子與藥物分子之間無法結合或結合力降低，使真菌獲得耐藥性。唑類藥物的靶酶過量表達也獲得耐藥性，將耐藥菌株和敏感菌株相比較，大部分靶酶的mRNA含量升高的菌株其MIC值也相應增高[15]。

3.2.3 代謝途徑的改變 唑類藥物作用于真菌，導致14α-甲基-3,6-二醇在細胞內的異常積累而產生抗真菌作用。在耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)由于ERG3基因的突變，致使在細胞的14α-甲基-3,6-二醇被14α-甲基類甾醇代替。14α-甲基類甾醇在細胞內積累，能部分替代麥角固醇的功能，維持真菌的正常生長[16]。ERG3基因突變的真菌，細胞膜中缺乏麥角固醇，使得其對兩性霉素B交叉耐藥。

3.2.4 生物膜的形成 生物膜是真菌分泌于細胞外，包裹真菌表面的多糖蛋白質復合物，生物膜包裹的真菌細胞群體的生存形式區(qū)別于單個分散的游離狀態(tài)真菌細胞[17]。膜內真菌細胞的形態(tài)常與游離菌不同，對藥物的敏感性差，其耐藥機制可能與下列因素有關：①生物膜中的細胞營養(yǎng)受到限制而使菌株生長緩慢；②胞外聚合物基質形成膜屏障；③表面誘導性耐藥基因的表達[18]。當真菌的生物膜被破壞重新懸浮后置于抗真菌藥物環(huán)境中, 這些真菌細胞仍對抗真菌藥物耐藥，這表明真菌生物膜耐藥是其細胞本身的內在特性。

3.3 對棘白菌素類耐藥機制

棘白菌素類藥物耐藥機制研究最為深入的是FKS1基因突變介導的耐藥機制。FKS1基因編碼的Fksp亞基是葡聚糖合成酶復合物的主要催化亞基，是棘白菌素作用的靶點。FKS1基因發(fā)生突變，將葡聚糖合成酶對藥物的敏感度降低為原來的十分之一或更低[19]，臨床分離的耐藥菌株中，F(xiàn)KS1基因的突變主要集中在Phe641Pro648(HS1)之間的氨基酸序列和Asp1357Leu1364(HS2)之間的部分[20]，HS1和HS2的突變對棘白菌素類藥物有廣泛影響，對米卡芬凈和阿尼芬凈有交叉耐藥現(xiàn)象。目前，還沒有直接證據(jù)證明該區(qū)域是否由于包含棘白菌素類藥物的結合區(qū)域而導致藥物活性降低。體外試驗證實[21]，自發(fā)突變導致的FKS1多態(tài)性與一些非白念珠菌對棘白菌素類藥物的敏感性降低有關。

真菌細胞壁在合成、修飾、重排過程中受到嚴密的調控，會對多種細胞壓力作出應激反應[22]，產生適應性改變而耐藥。Rho1是葡聚糖合成酶的激活因子，在細胞壁合成和調節(jié)過程中能直接激活葡聚糖合成酶，通過蛋白激酶C(PKC)的細胞完整性途徑和分泌途徑起到調節(jié)作用。當棘白菌素類藥物作用于真菌細胞壁時，細胞通過受體Wsc1和Mid2介導產生應激，與Rho1相互作用產生一系列的次級交互作用(包括PKC細胞完整性途徑和Slt2的激活)。細胞壁受到卡泊芬凈的損傷會誘導Wsc1產生，Wsc1是一個專一的傳感器和激活劑，能激活壓力信號肽Slt2，Slt2通過補救途徑產生保護應答，從而進行新的細胞壁合成。β-1,3-葡聚糖合成酶、β-1,3-葡聚糖轉移酶和葡聚糖合成調控因子是β-1,3-葡聚糖的裝配和調節(jié)有關的亞基。編碼這些亞基的基因與包括細胞壁裝配和極化生長的核心基因在內的基因相連接形成復雜的途徑網(wǎng)絡。這些復雜的途徑網(wǎng)絡可以調節(jié)來自棘白菌素類藥物作用于細胞壁壓力[23]。這些途徑的改變導致真菌對棘白菌素的耐藥性是適度的，因此這種耐藥性是真菌細胞對棘白菌素類藥物的耐受，是對環(huán)境壓力的細胞生理上的適應，而非耐藥性。

3.4 對核苷類藥物的耐藥機制

5-FC的繼發(fā)性耐藥機制為真菌阻止5-FC代謝成毒性物質，尿嘧啶核酸核糖轉移酶(UPRTase)負責5-氟尿嘧啶向5-氟尿苷-磷酸鹽的轉換(由FUR1基因編碼)。功能缺失或缺陷的UPRTase不能有效地把5-FC轉化成氟尿嘧啶脫氧核苷，故出現(xiàn)耐藥。在白念珠菌5-FC高度耐藥株中，F(xiàn)UR1基因的C301T突變發(fā)生在編碼尿嘧啶核酸核糖轉移酶基因的保守區(qū)域。在菌株的遺傳位點上存在著耐藥基因FCY(FCY為顯性，fcy為隱性)，對5-FC耐藥是隱性遺傳。因此，F(xiàn)CY/FCY菌株其UPRTase活性高，對5-FC敏感；雜合子FCY/fcy，其UPRTase活性減弱，對5-FC部分耐藥；雜合子進一步突變?yōu)閒cy/fcy，其UPRTase幾乎沒有活性，對5-FC完全耐藥[24]。

深部真菌感染嚴重威脅著患者的生命，一些抗真菌藥物控制了真菌感染的進展，緩解患者的癥狀，但是抗真菌藥物耐藥的出現(xiàn)，導致治療失敗，使深部真菌感染的治療面臨巨大的挑戰(zhàn)。真菌耐藥的機制非常復雜，通過對耐藥真菌體內外實驗，對真菌的一些耐藥機制有了一定的認識，指導臨床醫(yī)師合理利用抗真菌藥物，減少耐藥真菌的產生，同時為新藥的研發(fā)提供了理論依據(jù)。但是，目前研究的耐藥機制并不能解釋所有真菌耐藥的情況，一些不包含有耐藥基因的真菌也出現(xiàn)對抗真菌藥物的耐藥，這表明還有其他的耐藥機制存在。因此，需要不斷對抗真菌藥物的耐藥機制進行更為深入的研究。隨著深部真菌感染的患者不斷增多，抗真菌藥物的長期、反復應用，真菌與抗真菌藥物相互作用的同時，新的耐藥機制也會不斷產生，診療真菌感染及解決真菌耐藥問題的任務可謂任重而道遠。

[ 1 ] 代華,陳木英,陳立宇，等，深部真菌感染的耐藥機制研究進展[J].華西醫(yī)學,2001,26(1):142-145.

[ 2 ] 扈容英.醫(yī)院內侵襲性真菌感染的前瞻性研究[D].寧夏醫(yī)科大學,2013.

[ 3 ] 黃奕江. 侵襲性真菌感染的流行病學及其高危因素[J]. 臨床內科雜志, 2008, 25(4): 221-223.

[ 4 ] Mishra NN, Prasad T, Sharma N, et al . Pathogenicity and drug resistance in Candida albicans and other yeast species . A review[J] . Acta Microbiol Immunol Hung, 2007, 54(3):201-235.

[ 5 ] 王愛平,李若瑜.系統(tǒng)抗真菌藥物概述[J].中國藥物評價,2012,29(1):10-13.

[ 6 ] Odds FC, Brown AJ, Gow NA. Antifungal agents: mechanisms of action[J]. Trends Microbiol,2003,11(6):272-279.

[ 7 ] Kartsonis NA, Nielsen J, Douglas CM. Caspofungin: the first in a new class of antifungal agents[J]. Drug Resist Updat,2003, 6(4): 197-218.

[ 8 ] 李婷婷,朱若華,蔡光明，等.抗真菌藥物的研究進展[J].中國藥房, 2010,21(16):1533-1536.

[ 9 ] 崔宇慧,唐建國.真菌對臨床抗真菌藥物的耐藥機制[J].中國抗生素雜志,2011,10(36):733-737.

[10] Rock FL, Mao W, Anya YA, et al. An antifungal agent inhibits an aminoacyl-tRNA synthetase by trapping tRNA in the editing site[J]. Science, 2007, 316(5832): 1759-1761.

[11] 張維杰,李輝,劉廣彬.克柔念珠菌耐藥機制的研究[J].中國醫(yī)藥指南，2012,10(33):380-381.

[12] Coste A, Turner V, Ischer F, et al. A mutation in Tac1p,a transcription factor regulating CDR1 and CDR2, is coupled with loss of heterozygosity at chromosome 5 to mediateantifungal resistance inCandidaalbicans[J]. Genetics, 2006, 172(4): 2139-2156.

[13] deMicheli M, Bille J, Schucller C, et al, A common drugresponsive element mediates the upregulation of theCandidaalbicansABC transporters CDR1 and CDR2, two genes involved in antifungal drug resistance[J]. Mol Microbiol, 2002, 43(5):1197-1214.

[14] Calabrese D, Bille J, Sanglard D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily fromCandiaalbicansFLU11 confering resistanec to fluconazole[J]. Mol Microbiol, 2000,146(6): 2743-2756.

[15] 景偉芳,王惠平.白念珠菌對唑類藥物耐藥機制的研究進展[J].國際皮膚性病學雜志, 2010, 36(5): 287-289.

[16] Chau AS, et al. Inactivation of sterol Delta5,6-desaturase attenuates virulence inCandidaalbicans[J]. Antimicrob Agents Chemother,2005, 49(9):3646-3651.

[17] 索桂英, 付萍. 白念珠菌氟康唑耐藥機制的研究進展[J]. 皮膚病與性病, 2013, 35(2): 90-91,94.

[18] Vediyappan G,Rossignol T,D′Enfert C.Interaction ofCandidaalbicansbiofilms with antifungals: transcriptional response and binding of antifungals to beta-glucans[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(5): 2096-2111

[19] Kahn JN, Garcia-Effron G, Hsu MJ, et al. Acquired echinocandin resistance in aCandidakruseiisolate due to modification of glucan synthase[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(5): 1876-1878.

[20] Miller CD, Lomaestro BW, Park DS, et al. Progressive esophagitis caused byCandidaalbicanswith reduced susceptibility to caspofungin[J]. Pharmacotherapy, 2006, 26(6): 877-880.

[21] Espinel-Ingroff A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: yeasts and filamentous fungi[J]. Rev Iberoam Micol, 2008, 25(2): 101-106.

[22] Perlin DS. Antimicrobial resistance: resistance to echinocandin-class antifungal drugs[J]. Drug Resist Updat, 2007, 10(3): 121-130.

[23] 閔濤玲, 胡海峰.棘白菌素類抗真菌藥物耐藥機制研究[J]. 世界臨床藥物, 2010, 31(6): 376-380.

[24] Kanafani ZA, Perfect JR. Antimicrobial resistance: resistance to antifungal agents: mechanisms and clinical impact[J]. Clin Infec Dis, 2008,46(1): 120-128.

Common antifungal agents for treating deep fungal infections and the potential mechanisms of resistance

MAI Jia, WANG Jing

. (Respiratory and Critical Care Medicine, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China)

河南省重點科技攻關項目(編號：2011020002)。

鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥二科，鄭州 450000。

買佳(1987—)，女，碩士研究生，主要從事呼吸內科疾病的診斷與治療。

王靜，E-mail:wangjing@zzu.edu.cn。

R978

A

1009-7708(2015)04-0395-04

2014-07-24

2014-09-22