王英莉

酶聯(lián)免疫檢測抗-HCV方法的探討與試劑的評價

王英莉

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(HCV)感染導(dǎo)致的肝臟發(fā)生炎癥壞死和纖維化的嚴重傳染病。HCV的主要傳染源有急性和慢性丙型肝炎患者及HCV無癥狀攜帶者。主要通過輸血及血制品傳播。血液傳播是以前最主要的丙肝傳播途徑,不過隨著獻血者的篩查,此傳播方式已得到明顯控制,但是由于目前檢查手段的原因,輸血仍有傳播丙型肝炎的可能,特別是反復(fù)輸血、血制品者。為控制輸血傳播HCV,必須用敏感準(zhǔn)確的方法對獻血員獻出的血液進行HCV抗體檢測。第三代診斷試劑是目前使用的抗-HCV檢測試劑最多的,多采用酶聯(lián)免疫間接法來檢測血清中HCV IgG抗體。由于IgG抗體出現(xiàn)的時間較晚,早期感染者采集的標(biāo)本很容易被漏檢；另外,還存在一定的假陽性結(jié)果,是血清中類風(fēng)濕因子以及非特異性IgG的吸附等干擾造成的。

丙型肝炎病毒；丙肝抗體；酶聯(lián)免疫法；雙抗原夾心法；窗口期；特異性

雙抗原夾心法診斷試劑借助生物素-親和素級聯(lián)放大,檢測IgM、IgG等總抗體,縮短了窗口期,同時提高了試劑靈敏度。

試驗原理：夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法是微孔板內(nèi)預(yù)包被基因工程重組表達的HCV抗原,第一步加入生物素化HCV抗原和血清或血漿樣本,樣本中的HCV抗體能與包被抗原及生物素化HCV抗原相結(jié)合,形成“包被抗原-抗體-生物素化抗原”復(fù)合物；第二步加入酶標(biāo)試劑,溫育并洗滌后加入TMB底物顯色。若樣品為HCV抗體陽性,HRP催化底物顯色,若樣本為陰性,則不顯色。加入終止液后,通過酶標(biāo)儀測定吸光值(A值),從而判斷樣本中丙型肝炎病毒HCV)抗體的存在與否。間接ELISA法是微孔板內(nèi)預(yù)包被基因工程重組表達的HCV抗原與血清或血漿中抗HCV抗體反應(yīng),再加入HRP標(biāo)記抗人IgG的酶標(biāo)記抗體與之結(jié)合,然后用TMB系統(tǒng)作用顯色。

目前萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的雙抗原夾心法診斷試劑的敏感性和特異性均優(yōu)于間接法,本實驗室對雙抗原夾心法與間接法進行了性能檢測,分別采用三種試劑對7632份血漿樣本同時進行檢測,現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 血漿樣本 遼陽市中心血站2013年5月20日～11月20日獻血員血漿樣本共7632份。

1.2 試劑 抗-HCV間接法檢測試劑：廈門英科新創(chuàng)股份有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒,批號2012085822；抗-HCV雙抗原夾心法檢測試劑：北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒,批號CS20130301；確認試劑：丙型肝炎病毒抗體確證試劑盒(重組免疫印跡法) 批號：RC20131001。

1.3 方法 對于7632份樣本采用雙抗原夾心法與間接法同時檢測抗-HCV。采用Chiron,RIBA對上述任一試劑檢測為陽性或可疑的樣本進行檢測。

2 結(jié)果

7632份檢測樣本中,7597份為陰性,26份均為陽性,1份間接法檢測為陰性雙抗原夾心法檢測為陽性,6份間接法檢測為陽性雙抗原夾心法檢測為陰性,2份雙抗原夾心法陰性而間接法檢測OD值為接近臨界值的可疑樣本。

間接法和雙抗原夾心法檢測均為陽性的26份樣本中,RIBA確證實驗結(jié)果21例為陽性,1例為陰性,4 例為可疑；間接法檢測為陽性雙抗原夾心法檢測為陰性的6例樣本4例確證為陰性,2例確證為可疑,間接法檢測為陰性雙抗原夾心法檢測為陽性的1例樣本確證為陽性。

目前公認的檢測丙肝抗體的準(zhǔn)確方法為RIBA,以此為標(biāo)準(zhǔn),本實驗室間接法和雙抗原夾心法的特異性分別統(tǒng)計為99.65％(7605 /7632)和99.55％(7598 /7632)。

實驗結(jié)果證實了雙抗原夾心法與RIBA的符合率為96.3％ ,間接法與RIBA的符合率為76.5％,抗-HCV雙抗原夾心法的特異性比間接法提高了一個百分點,所產(chǎn)生的灰區(qū)和假陽性樣本大幅度減少。

另外,間接法只檢測IgG,雙抗原夾心法增加了IgM的檢測,因此窗口期縮短,提高了獻血員抗-HCV的檢出率；同時檢測時加樣量從間接法的10 μl提高到50 μl,大大減少了全自動加樣系統(tǒng)的漏加率,消除了一定的安全隱患。

3 討論

雙抗原夾心法與間接法相比較有如下特點：①夾心法間接法檢測IgM、IgG等總抗體檢測IgG抗體窗口期縮短；②形成包被抗原-抗體-生物素化抗原復(fù)合物形成包被抗原-抗體-抗人IgG抗體復(fù)合物特異性增強；③借助生物素-親和素級聯(lián)放大原理無生物素-親和素級聯(lián)放大效應(yīng)靈敏度提高；④方法學(xué)革新,加樣量增加(50 μl),減少試驗誤差方法學(xué)限制,加樣量有限(10 μl)；⑤抗-HCV ELISA檢測方法在不斷完善,應(yīng)用雙抗原夾心法檢測抗-HCV,實用性強,可降低非特異性反應(yīng),提高檢測準(zhǔn)確率,縮短窗口期,更好的減少血液浪費,避免輸血傳播疾病。

綜上所述,為了防止漏檢,《獻血者健康檢查要求》(GB 18467-2011) 明確要求血液篩查必須用兩種不同廠家試劑進行檢測,因此要定期進行試劑的質(zhì)量評價,正確選擇檢測試劑,既要增加靈敏度,又要有較高特異性,避免漏檢的風(fēng)險,減少血液資源的浪費,更好地為臨床提供安全合格血液為患者服務(wù)[1]。

[1]何敏,朱葉,馬洋,等. 抗-HCV雙抗原夾心法酶聯(lián)免疫檢測試劑的應(yīng)用評價.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報,2012,66(4):244-245 .

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.03.180

2014-11-14]

111000 遼陽市中心血站