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        牛細(xì)管凍精解凍后常溫保存對(duì)受胎率的影響試驗(yàn)

        2015-01-23 23:10:17張寶良馬玉婷竇世玲尹世東黃萬(wàn)光
        中國(guó)牛業(yè)科學(xué) 2015年2期
        關(guān)鍵詞:細(xì)管凍精受胎率

        張寶良,馬玉婷,孔 偉,竇世玲,尹世東,黃萬(wàn)光

        (甘肅省家畜繁育中心,733000)

        牛細(xì)管凍精解凍后常溫保存對(duì)受胎率的影響試驗(yàn)

        張寶良,馬玉婷,孔 偉,竇世玲,尹世東,黃萬(wàn)光

        (甘肅省家畜繁育中心,733000)

        [目的]為測(cè)試牛細(xì)管冷凍精液解凍后在常溫水中的保存時(shí)間對(duì)精子活力的影響,為非定點(diǎn)配種尋求有效簡(jiǎn)便的凍精攜帶方法,觀察精子在不同解凍溫度下的存活時(shí)間及受胎率。[方法]選擇5個(gè)解凍溫區(qū)及不同時(shí)間解凍肉牛細(xì)管凍精,解凍后置于常溫水(17~19℃)中保存,觀測(cè)解凍溫度和精子存活時(shí)間對(duì)受胎率的影響。[結(jié)果] 50℃、60℃、70℃、解凍后精子的保存時(shí)間差異不顯著,保存至72h時(shí)精子活力均低于0.35;受胎率差異不顯著;隨保存時(shí)間延長(zhǎng),受胎率呈下降趨勢(shì),在48h以內(nèi)情期受胎率和總受胎率分別維持在61.8%~67.1%和91.9~95.8。[結(jié)論]70℃各時(shí)間段解凍后保存效果最佳,60℃解凍組次之,二者在精子活力≥0.35時(shí)情期受胎率和總受胎率達(dá)到63.0%、92.5%,略高于當(dāng)?shù)攸S牛兩項(xiàng)受胎率的平均值61.1%、91.7%,解凍后細(xì)管精液置于常溫水中攜帶到較遠(yuǎn)的區(qū)域輸精對(duì)精子活力、母牛受胎率無(wú)影響。

        細(xì)管凍精;解凍時(shí)間;解凍溫度;精子活力;保存時(shí)間;受胎率

        人工授精技術(shù)做為當(dāng)今發(fā)展養(yǎng)牛業(yè)的重要技術(shù)措施,具有提高優(yōu)秀種公牛的利用率,大幅度減少種公牛飼養(yǎng)量,節(jié)約飼料和管理費(fèi)用,以及不受時(shí)間、地域和種公牛生命的限制等優(yōu)越性,在牛繁殖改良中發(fā)揮著極其重要的作用。很多地區(qū)各種自然條件的限制不能使人工授精技術(shù)優(yōu)勢(shì)充分發(fā)揮;一是隨著我國(guó)肉牛養(yǎng)殖業(yè)的轉(zhuǎn)型和養(yǎng)殖結(jié)構(gòu)的變化,拉牛上站配種時(shí)代已基本結(jié)束,送技術(shù)上門和主動(dòng)服務(wù)成為市場(chǎng)主流,現(xiàn)場(chǎng)操作受諸多條件限制,缺乏必要的交通工具,下鄉(xiāng)服務(wù)液氮容器的攜帶就很困難,再者成本也較高,對(duì)儲(chǔ)存的其余凍精影響也很大。二是養(yǎng)殖場(chǎng)規(guī)模較大的場(chǎng)區(qū),配種室距授配母牛距離較遠(yuǎn),配種母牛較多,凍精解凍后沒(méi)有好的便捷方法攜帶,外界溫度不易控制,對(duì)精子活力和受胎率影響較大。對(duì)針對(duì)這些問(wèn)題,本試驗(yàn)采用不同溫度、不同解凍時(shí)間解凍牛細(xì)管凍精,通過(guò)常溫水長(zhǎng)時(shí)間保存,對(duì)比分析解凍后精子活力及生存時(shí)間,旨在尋找最佳解凍溫度、解凍時(shí)間及常溫水中保存時(shí)間,提高細(xì)管凍精解凍后活力和受胎率,解決以上問(wèn)題。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及材料

        1.1.1 動(dòng)物來(lái)源 試驗(yàn)動(dòng)物選自甘肅省家畜繁育中心繁育場(chǎng)和涼州區(qū)12個(gè)配種站點(diǎn)的201頭膘情中上,發(fā)情正常,無(wú)生殖道疾病的適齡母牛。

        1.1.2 試驗(yàn)器材 甘肅省家畜繁育中心種公牛站按GB4143-2008生產(chǎn)的0.25ml牛細(xì)管冷凍精液、數(shù)字解凍器、10L液氮罐、載玻片、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡、溫度計(jì)、恒溫板、鑷子等。

        1.2 方法

        1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 用數(shù)字精液解凍裝置在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃五個(gè)溫區(qū)解凍牛細(xì)管凍精,將不同溫區(qū)最佳時(shí)間段解凍效果好的凍精置于常溫水中保存,12 h前每隔4 h、12 h后間隔12h檢測(cè)記錄精子活力,在兩個(gè)時(shí)間段檢測(cè)出現(xiàn)活力低于0.35時(shí),再逆時(shí)推檢直至所有解凍細(xì)管凍精活力低于0.30,最終篩選出精子活力大于0.35的最長(zhǎng)保存時(shí)間,再進(jìn)行人工授精,測(cè)定保存后精子對(duì)的受胎率的影響。

        1.2.2 解凍方法 在數(shù)字精液解凍器上設(shè)置好解凍溫度,待達(dá)到所需溫度時(shí),用鑷子從液氮罐中迅速抽取一支細(xì)管凍精,輕輕甩掉液氮,立即將其放入準(zhǔn)備好的解凍器中并輕輕搖晃,達(dá)到設(shè)定時(shí)間后把細(xì)管取出,置于裝滿自來(lái)水500 mL小口瓶(受季節(jié)不同,水溫有浮動(dòng),平均維持在14℃左右)中室內(nèi)保存,解凍好試驗(yàn)所需數(shù)量細(xì)管凍精后,取三支細(xì)管凍精擦干,剪去兩頭封口端用取10ul精液于載玻片上加蓋玻片后,在帶有恒溫板(恒溫板溫度設(shè)置38℃)的光學(xué)顯微鏡下觀察精子活力,每個(gè)鏡片觀察3~5個(gè)以上視野,進(jìn)行活力評(píng)判并記錄。

        1.2.3 配種方法 選擇解凍后常溫水中保存精子存活時(shí)間≥48 h、活力≥0.35的解凍溫區(qū)解凍后的凍精,于2 h、12 h、24 h、48 h后給發(fā)情母牛適時(shí)輸精,每次使用凍精1~2支。在21 d、45 d、60 d、90 d觀察和直腸檢查母牛受孕狀態(tài), 測(cè)定情期受胎率和總受胎率,將≥21 d未發(fā)情確定為情期受胎率,>90 d以上未發(fā)情,直腸檢查已受孕按總受胎率計(jì)算。

        1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用Excel 和SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),結(jié)果用平均值來(lái)表示。

        2 試驗(yàn)結(jié)果

        2.1 解凍溫度和時(shí)間對(duì)精液活力的影響

        鏡檢三個(gè)視野直線前進(jìn)精子數(shù)達(dá)0.35以上為合格,不同解凍溫度、時(shí)間下的精子活力見(jiàn)圖1。由圖1可知,不同解凍溫度、時(shí)間下的精子活力各異。溫度越高,所需解凍時(shí)間越短,但隨解凍時(shí)間的延長(zhǎng),精子死亡也越快。同一解凍溫度下解凍時(shí)間長(zhǎng)短不同,精子活力也不相同,不同解凍溫區(qū)都有一個(gè)最佳解凍時(shí)間段。90℃細(xì)管凍精的最佳解凍時(shí)間范圍為3~4 s,解凍活力0.4~0.45;80℃最佳解凍時(shí)間為4~5 s,解凍活力0.45;70℃最佳解凍時(shí)間范圍為4~6 s,解凍后活力0.41~0.45,顯著高于其他時(shí)間段解凍后的活力;60℃最佳解凍時(shí)間范圍為7~8 s,解凍后活力0.40,高于其他時(shí)間段解凍后的活力;50℃的最佳解凍時(shí)間范圍為20~30 s,解凍后活力0.4~0.43;而80℃2 s、70℃2 s、60℃2 s和3 s、50℃2 s和3 s解凍后精子沒(méi)能復(fù)蘇;90℃5 s、807 s、70℃8 s、60℃12 s解凍后凍精精子全部死亡。

        2.2 常溫水中保存對(duì)精子活力的影響

        不同溫度、時(shí)間解凍細(xì)管凍精后的保存效果如表1所示。由表1可見(jiàn):不同溫度、時(shí)間解凍細(xì)管凍精后,隨保存時(shí)間延長(zhǎng),精子活力均呈下降趨勢(shì)。其中90℃和80℃解凍組精子活力下降幅度較快,保存時(shí)間較短。在0~4 h內(nèi)精子活力差異不顯著(\%P>0.05);\%8 h以后活力下降明顯,顯著低于前幾個(gè)小時(shí)(\%P\%<0.05);保存至24h、36h時(shí)精子活力均低于0.35。70℃、60℃、50℃解凍組精子活力下降幅度緩慢,保存時(shí)間達(dá)72 h時(shí),各組活力降至0.35以下,時(shí)間明顯長(zhǎng)于90℃和80℃兩組;解凍后0~12 h內(nèi),70℃組的平均精子活力顯著高于其他兩組(\%P\%<0.05),60℃解凍組次之,且70℃和60℃解凍組的精子活力維持在0.37~0.44之間;12~48 h時(shí)各組精子活力基本維持穩(wěn)定,保持在0.35~0.36之間,各組差異不顯著(\%P\%>0.05)。

        2.3 解凍溫度和保存時(shí)間對(duì)受胎率的影響

        不同解凍溫度和保存時(shí)間對(duì)受胎率的影響見(jiàn)表2,由表2可以看出在50℃、60℃、70℃三個(gè)溫區(qū)解凍后的凍精對(duì)母牛受胎率影響差異不顯著(\%P\%<0.05);隨凍精保存時(shí)間的延長(zhǎng),母牛情期受胎率和總受胎率均有所降低,在48小時(shí)以內(nèi),情期受胎率和總受胎率分別維持在61.8%~67.1%和91.9%~95.8%,平均情期受胎率和總受胎率達(dá)63.0%、92.5%,略高于當(dāng)?shù)攸S牛兩項(xiàng)受胎率的平均值61.1%、91.7%。

        3 結(jié)論與討論

        3.1 解凍溫度和時(shí)間對(duì)精子存活時(shí)間的影響

        試驗(yàn)結(jié)果表明,在50~90℃5個(gè)溫區(qū)范圍內(nèi)解凍牛細(xì)管凍精,每個(gè)溫區(qū)都內(nèi)都有一個(gè)解凍的最佳時(shí)間段,90℃解凍的最佳解凍時(shí)間是3 s~4 s,80℃是4~5 s,70℃是4~6 s,60℃是7~8 s,50℃是20 s~30 s。在這些溫區(qū)解凍細(xì)管凍精后于常溫水中保存的效果各有差異。其中以70℃保存效果最佳,解凍后精子活力最高,保存時(shí)間最長(zhǎng),60℃次之。90℃和80℃解凍后保存時(shí)間較短。說(shuō)明凍精解凍后的保存效果與解凍溫度有很大的關(guān)系,在解凍精液時(shí)如何快速越過(guò)精子的冰晶期這是一個(gè)重要環(huán)節(jié)[1]。精子在冰晶化、玻璃化及復(fù)蘇時(shí)最容易發(fā)生死亡,也是解凍后精液活力快速下降的主要原因之一。高溫快速解凍可以使精子冰晶化、玻璃化及復(fù)蘇時(shí)間大大縮短,從而使精子細(xì)胞結(jié)構(gòu)得到保護(hù),使精子損傷降到最低,減少了精子不必要的死亡,提升了解凍后精子的活力;低溫精子處于休眠狀態(tài),活動(dòng)量降低,精子能量消耗少,精子死亡率小[1-2],將高溫解凍后的凍精放入常溫水中保存,可以有效延長(zhǎng)精子的保存時(shí)間,500 ml水在20~25℃自然條件下24h升溫不到2℃,不會(huì)造成保存環(huán)境溫度出現(xiàn)波動(dòng)起伏,很好的保持了精子生命狀態(tài)的穩(wěn)定,延長(zhǎng)了保存時(shí)間和維持受精的能量,用此方法運(yùn)輸保存解凍后的牛細(xì)管凍精,在牛改良上門服務(wù)、偏遠(yuǎn)地區(qū)及養(yǎng)殖場(chǎng)配種,攜帶解凍后凍精非常經(jīng)濟(jì)方便。

        3.2 解凍溫度和保存時(shí)間對(duì)受胎率的影響

        母牛受胎率的高低,直接影響著品種改良速度和養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)效益,而受胎率的高低與凍精的解凍溫度,輸精時(shí)間、牛的膘情、發(fā)情時(shí)間等因素息息相關(guān)[3]。從試驗(yàn)結(jié)果也可以看出,隨著凍精保存時(shí)間的延長(zhǎng),母牛情期受胎率和總受胎率均呈下降趨勢(shì),分析其原因主要是,隨著凍精保存時(shí)間的延長(zhǎng),精子的能量耗損逐漸升高,代謝產(chǎn)物積聚,降低和抑制了精子活動(dòng)能力,導(dǎo)致受胎率下降。在細(xì)管凍精解凍過(guò)后的24 h以內(nèi)用于配種對(duì)受胎率影響不大,此法也可用于凍精解凍后,母牛處在不適宜配種階段的精液短時(shí)間保存,有效延長(zhǎng)解凍后精液攜帶保存時(shí)間,對(duì)交通不便、技術(shù)人員較少、路途遙遠(yuǎn)的散養(yǎng)戶和場(chǎng)區(qū)較大、操作間距離配種點(diǎn)較遠(yuǎn)的飼養(yǎng)場(chǎng),具有很大的優(yōu)勢(shì)。對(duì)加快黃牛改良步伐、適當(dāng)減少配種點(diǎn)、降低黃牛改良的投入和成本、提高肉牛細(xì)管凍精受胎率意義重大。

        [1] 張永春,張顯華,劉東升,等.解凍溫度和保存時(shí)間對(duì)牛細(xì)管凍精精子活率的影響[J].中國(guó)奶牛,2013.15:60-62.

        [2] 郝愛(ài)玲,阿淑艷,李淑坤.不同溫度解凍對(duì)凍后精子活力及生存時(shí)間的影響[J].中國(guó)奶牛業(yè)發(fā)展會(huì),2006,2:683-684.

        [3] 劉小明,李東.解凍精子存活時(shí)間對(duì)受胎率的影響[J].寧夏農(nóng)林科技,2000.6:35-36.

        Impact on conception rate of the thawed bovine straw semen preserved in water at room temperature

        ZHANG Bao-Liang , MA Yu-ting , KONG Wei , DOU Shi-ling , YIN Shi-dong, HUANG Wan-guang

        (LivestockbreedingcenterinGansuProvince, 733000 )

        [Objective] To test the effect of storage time in water at room temperature of cattle straw frozen semen after thawing on sperm motility, seek effective and easy semen carrying method for non- sentinel mating , observe the survival time and conception rate of thawed sperm at different temperatures . [Method] At 5 thawing temperature zones and different time thawed beef thin tube semen, after thawing preserved in the water at room temperature (17 ~ 19 ℃), observed effect of thawing temperature and sperm survival time on conception rate . [Results]At 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃ thawed, the saved time of sperm was no significant differences , when saved to 72h sperm motility were lower than 0.35 ; conception rate was not significant ; With prolonged storage time, the conception rate declined, within 48h estrus conception rate and overall conception rate remained at 61.8% ~ 67.1% and 91.9 ~ 95.8% . [Conclusion] Thawed each time of 70 ℃, preservation effect is the best , 60 ℃ followed, both in sperm motility ≥ 0.35 when estrus conception rate and overall conception rate reached 63.0% , 92.5% , slightly higher than the local cattle two of the average conception rate 61.1% 91.7% . Saved the straw semen in water at room temperature after thawing, carry to far regional inseminated, had no effect on sperm motility and pregnancy rate.

        thin tube semen ; thawing time ; thawing temperature ; sperm motility ; retention time ; conception rate

        2014-12-26 修改日期:2015-01-20

        張寶良(1986-),男,甘肅靖遠(yuǎn)縣人,本科,助理畜牧師,主要從事牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)工作。

        S8-1

        A

        1001-9111(2015)02-0041-04

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