李海濤， 潘頻華

·綜述·

鮑曼不動桿菌疫苗研究進展

李海濤， 潘頻華

鮑曼不動桿菌； 疫苗； 蛋白

鮑曼不動桿菌存在于醫(yī)院環(huán)境并在患者多部位定植，導致醫(yī)院獲得性肺炎、血流感染、腹腔感染、腦膜炎、皮膚軟組織感染和泌尿系感染等［1］。由于其強大的獲得耐藥性及克隆傳播能力，鮑曼不動桿菌已成為全球流行并呈高度耐藥的常見致病菌［2］。在我國，鮑曼不動桿菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染最常見的病原菌之一，2012年我國9省市15所教學醫(yī)院臨床檢出的革蘭陰性菌標本中，鮑曼不動桿菌達15.05%，僅次于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，其中大多數(shù)為多重耐藥菌［3］。在部分重癥監(jiān)護病房，多重耐藥鮑曼不動桿菌已居醫(yī)院感染的第1位［4］。需要警惕的是，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌感染率持續(xù)上升，并逐漸成為最常見的基因表型［5-6］。由于鮑曼不動桿菌耐藥性日趨嚴重，新的有效抗菌藥物研發(fā)遲滯，近年，國外許多學者嘗試通過研制針對性細菌疫苗的手段來防治鮑曼不動桿菌，現(xiàn)就鮑曼不動桿菌疫苗研制的新進展綜述如下。

1 滅活疫苗

滅活全菌體（inactivated whole cell，IWC），作為最簡單快捷的人工免疫方式，以滅活病原微生物制備抗原誘導免疫應(yīng)答預(yù)防感染是優(yōu)先考慮的方法。McConnell等［7］和Harris等［8］分別以腹腔接種和鼻內(nèi)接種方式構(gòu)建鮑曼不動桿菌感染小鼠肺炎模型，并分別以ATCC 19606毒株和LAC-4毒株制備甲醛滅活全菌體疫苗并肌注免疫小鼠。在接種IWC的小鼠可以觀察到明顯的主動免疫，表現(xiàn)為；①免疫后在小鼠體內(nèi)可以檢測到明顯的特異性抗體升高；②免疫小鼠組織細菌負荷量，及血清細胞因子明顯減少；③以不同鮑曼不動桿菌毒株感染小鼠，IWC免疫組小鼠生存率接近100%，而未免疫組小鼠則不足20%。研究同樣表明，注射IWC抗血清后再感染鮑曼不動桿菌小鼠未出現(xiàn)感染死亡，說明IWC抗血清具有明顯的被動免疫保護作用。IWC的主動和被動免疫均對鮑曼不動桿菌感染有保護作用。KuoLee等［9］最近的研究指出，IWC滴鼻亦能誘導體液免疫的產(chǎn)生，但與黏膜免疫相關(guān)的sIgA并無明顯升高，且免疫血清無被動免疫保護作用。IWC雖然有明顯的主動及被動免疫保護作用，但問題也很明顯；①IWC免疫原性不強，需大劑量多次接種；②IWC在制作過程中可能出現(xiàn)導致滅活不完全，接種免疫后危及患者生命；③IWC無效成分過多，其中內(nèi)毒素可能加重患者病情。

2 外膜蛋白疫苗

2.1 外膜復合物（outer membrane complex，OMC）

為解決以上問題，McConnell等［10］進一步提出OMC可能成為一個較為安全的鮑曼不動桿菌候選疫苗。OMC為超速離心提取自鮑曼不動桿菌外膜，其包含細胞膜上多個蛋白質(zhì)成分，具有一定的免疫原性。選擇ATCC 19606毒株提取OMC，免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)；①單次免疫效果良好，能誘導小鼠體液免疫及細胞免疫（反映指標為IgG及INF-α明顯升高）；②降低小鼠感染后組織細菌負荷量及炎性因子水平；③OMC能保護小鼠免于鮑曼不動桿菌致死感染；④小鼠OMC抗血清保護小鼠免于鮑曼不動桿菌感染引起膿毒癥所致死亡，有明顯的被動免疫保護作用。該研究結(jié)果與IWC研究結(jié)果［7］高度一致，從安全性考慮而言，OMC較IWC為優(yōu)。

2.2 外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMV）

OMV是由革蘭陰性菌外膜外翻分泌形成，其中包裹了大量的外膜蛋白、間質(zhì)蛋白和脂多糖。Bomberger等［11］的研究表明，由于OMV能與宿主細胞外膜融合，提示OMV可能遠距離輸送細菌產(chǎn)物，也解釋其群體感應(yīng)（quorum sensing）、毒力因子傳播、基因-基因轉(zhuǎn)換等作用，表明在細菌致病過程中OMV發(fā)揮了重要作用。McConnell等［12］研究提示，OMV同樣也能成為鮑曼不動桿菌候選疫苗。其作為候選疫苗優(yōu)勢在于；①OMV中內(nèi)毒素水平可控制在（1.3 ±0.01）×105EU/μg，較IWC和OMC明顯降低；②OMV接種后同樣引起小鼠體液免疫應(yīng)答，而且二次強化免疫后能明顯增加特異性IgG和IgM水平；③OMV接種后降低了小鼠感染后組織細菌負荷量及炎性因子水平（IL-1β、IL-6）；④OMV誘導保護性免疫，明顯降低了鮑曼不動桿菌膿毒癥小鼠模型死亡率。另外，OMV制備只需過濾鮑曼不動桿菌上清液并加以濃縮便可，方法簡單而快速。但OMV抗血清沒有被動免疫保護作用；通常對來自所提取的單克隆特異性毒株免疫效果最佳，因而，可能更適用鮑曼不動桿菌感染暴發(fā)時快速制備OMV預(yù)防新的感染；雖然OMV內(nèi)毒素水平低于IWC和OMC，但仍然超過了人體所能承受的水平。

IWC、OMC和OMV均屬于多抗原成分，其優(yōu)勢在于能有效地避免因多克隆毒株的存在使得疫苗效果降低。實驗結(jié)果表明，其對鮑曼不動桿菌的其他血清型所致膿毒癥感染也有保護作用［7-8，10，12］，原因可能是多抗原成分發(fā)揮的交叉免疫作用，也可能是其中存在高度保守基因所編碼的抗原成分；其缺點同樣明顯；由于其所含成分繁多且復雜，在生產(chǎn)過程中難以標準化疫苗劑量；而且其中脂多糖（內(nèi)毒素）含量超過了人體所能承受的上限，限制了在人體中的應(yīng)用?；蛟S通過滅活鮑曼不動桿菌中編碼脂多糖合成途徑的相關(guān)基因，獲得相應(yīng)疫苗是減低內(nèi)毒素水平的可行方式之一。

3 重組蛋白疫苗

3.1 生物膜相關(guān)蛋白（biofilm associated protein，Bap）

由于IWC、OMC和OMV在臨床應(yīng)用推廣受限以及對鮑曼不動桿菌研究的深入，成分單一、免疫原性強的亞單位蛋白疫苗成為研究熱點。Bap是一種特異的細胞表面蛋白，與鮑曼不動桿菌生物膜早期形成及成熟相關(guān)，在細菌感染過程中起重要作用。Fattahian等［13］以重組亞單位Bap免疫小鼠3次，ELISA證實了小鼠體內(nèi)產(chǎn)生對Bap的體液免疫，Bap特異性IgG抗體效價較對照組明顯升高；免疫后小鼠在接種半數(shù)致死劑量細菌（107）18 h后組織細菌計數(shù)明顯減少，而未免疫小鼠此時均已死亡，提示Bap能有效降低小鼠免于鮑曼不動桿菌膿毒癥感染所致死亡的風險。Bap作為傳統(tǒng)疫苗的免疫優(yōu)勢區(qū)是保守的，在不同毒株中存在相同的免疫表型（Bap誘導抗體對Kh0058、Kh0059、Kh0097、Kh0099等毒株均有效），使得Bap作為疫苗能對抗多個鮑曼不動桿菌克隆毒株。但抗Bap血清不能發(fā)揮被動免疫保護功能。

3.2 外膜蛋白A（outer membrane protein，Omp A）

OmpA是目前明確的毒力因子，在鮑曼不動桿菌外膜中含量豐富［14］，且在不同鮑曼不動桿菌毒株中氨基酸序列高度保守，PubMed BLAST檢索結(jié)果證實其人類蛋白組學同源性最小，避免誘發(fā)產(chǎn)生自身抗體的可能。Luo等［15］以重組Omp A（rOmpA）免疫糖尿病小鼠后發(fā)現(xiàn)；①rOmp A誘發(fā)了明顯的體液免疫，表現(xiàn)為抗rOmp A抗體效價明顯增高，小鼠28 d生存率由0提高到50%左右，且rOmp A抗體效價與小鼠的存活率呈正相關(guān)；②同時明顯降低腦、腎、肝、脾組織細菌負荷量（但肺組織中細菌負荷量的下降無統(tǒng)計學意義）。另外，作者亦研究了rOmp A抗血清的免疫治療作用，雖然免疫血清不能增強補體介導的殺菌作用，但rOmp A抗體能增強巨噬細胞調(diào)理吞噬殺傷鮑曼不動桿菌，從而發(fā)揮免疫調(diào)理作用。鮑曼不動桿菌菌落培養(yǎng)上清液所獲得的OmpA是水溶性并具有生物活性，但原核表達rOmp A則不溶于水［16］，因此在其表達上仍需進一步研究。

3.3 三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白（trimeric autotransporter protein Ata）

Ata，一種鮑曼不動桿菌表面蛋白成分，附著于許多細胞外基質(zhì)或基膜蛋白，是形成致病力、生物菌膜及對Ⅳ型膠原纖維黏附所必需［17］。Bentancor等［18］的研究顯示；①Ata抗體可以阻礙鮑曼不動桿菌黏附Ⅳ型膠原纖維，從而減低鮑曼不動桿菌致病力；②Ata抗體不但可以促進多核中性粒細胞（PMNs）調(diào)理吞噬殺傷鮑曼不動桿菌，還能介導補體依賴的殺菌作用；③抗Ata血清可以降低小鼠感染后組織細菌負荷量，提示Ata是一個保護性免疫的重要靶點。

Bap、Omp A、Ata均為保守基因表達產(chǎn)物，具有高度同源性，并覆蓋了較大部分的鮑曼不動桿菌毒株，表現(xiàn)了良好的免疫效果，是潛在疫苗候選抗原?；蚬こ讨亟M技術(shù)生產(chǎn)疫苗具有成分單一、重復性好、產(chǎn)品批間差異小、易于控制細菌內(nèi)毒素含量等優(yōu)勢，不存在疫苗劑量定量的困擾，是現(xiàn)代疫苗開發(fā)的重要方向之一。但單一成分疫苗可能免疫保護不足，或者將鮑曼不動桿菌置于強大的選擇壓力下誘導細胞膜靶向蛋白下調(diào)，出現(xiàn)免疫逃避導致疫苗最終失效。因此，篩選保守性好、免疫原性強的抗原，以便進行多抗原組合，是研制重組蛋白疫苗需重點解決的問題。

4 多糖疫苗

4.1 多聚-N-乙酰β葡聚糖（Poly-N-acetyl-βglucan，PNAG）

PNAG是一種表達于多株臨床分離的鮑曼不動桿菌表面的多糖，在體外生物膜的形成發(fā)揮了重要作用［19］。由于PNAG抗原性弱，Bentancor等［20］將合成PNAG與破傷風類毒素偶聯(lián)形成結(jié)合疫苗后，免疫兔并提取抗PNAG血清，被動免疫小鼠發(fā)現(xiàn)；①PNAG抗體可以高效介導多形核中性粒細胞（PMNs）的調(diào)理殺菌作用；②被動免疫后感染鮑曼不動桿菌的小鼠組織細菌負荷量明顯降低，發(fā)揮了保護性抗體作用。提示PNAG是一種潛在的候選疫苗抗原，有可能在主動免疫和被動免疫中發(fā)揮保護作用。

4.2 K1莢膜多糖

鮑曼不動桿菌細胞膜外還表達多種莢膜多糖，其中K1莢膜多糖與鮑曼不動桿菌的毒力密切相關(guān)，且不會誘導人體產(chǎn)生自身免疫［21-22］。Russo等［23］通過純化的K1莢膜多糖免疫小鼠并獲得抗K1莢膜多糖血清以驗證其被動免疫效果。實驗結(jié)果表明，在體外實驗中抗血清可以增強PMNs介導的調(diào)理吞噬作用，增強細菌清除率。但是，只有13%鮑曼不動桿菌為K1血清型，因此，K1莢膜多糖疫苗只適用于特定毒株，不能發(fā)揮有效的預(yù)防感染作用。

莢膜多糖主要誘導抗體產(chǎn)生調(diào)理作用殺傷鮑曼不動桿菌，相比較抗原性較弱，且保守性欠佳，并不是疫苗制備的最佳選擇，但豐富了疫苗選擇的思路。

幾乎所有成功的疫苗，人們均熟知自然免疫對抗感染的全過程，并盡量模仿其保護性免疫反應(yīng)。雖然目前鮑曼不動桿菌疫苗的研究取得了一定的進展，但許多技術(shù)依然陳舊，已不能滿足新疫苗開發(fā)的要求。近年來，逆向免疫學及蛋白質(zhì)組學的興起為疫苗制備指明了新的道路，通過對鮑曼不動桿菌保守位點的定位和基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計，國外學者從理論上篩選出多種鮑曼不動桿菌候選疫苗抗原［24］，Omp A、Bap亦位列其中。由于鮑曼不動桿菌基因組表達的多樣性及不穩(wěn)定性，多個亞單位的組合疫苗或許是未來鮑曼不動桿菌疫苗研究的重要方向。同時，目前已明確的抗體在動物實驗中表現(xiàn)出了良好的保護作用，開發(fā)特異性免疫球蛋白制劑甚至單克隆抗體制劑用于治療的被動免疫方法或?qū)⒊蔀檠芯糠较蛑弧?/p>

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Research progress of the vaccine against Acinetobacter baumannii

LI Haitao，PAN Pinhua.（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Central South University Xiangya Hospital，Changsha 410008，China）

R378

A

1009-7708（2015）02-0188-04

2014-05-20

2014-07-24

湖南省科技廳社會發(fā)展支撐課題（2013SK3023）。

中南大學湘雅醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，長沙410008。

李海濤（1989—），男，碩士，醫(yī)師，主要從事肺部重癥感染診治研究。

潘頻華，E-mail；pinhuapan668?hotmail.com。