李明舉 由佳 彭蕓蕓 （山東省煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 264003）

豬傳染性胃腸炎病毒基因及疫苗研究進(jìn)展

李明舉 由佳 彭蕓蕓 （山東省煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 264003）

豬傳染性胃腸炎是危害全世界養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一。預(yù)防和控制該病的主要措施之一就是疫苗接種，目前分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，對(duì)TGEV的研究取得了較大進(jìn)展，本文主要對(duì)近年來該病毒疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行了深入概括闡述，為進(jìn)一步做好該病防控工作貢獻(xiàn)微薄之力。

豬傳染性胃腸炎；基因組結(jié)構(gòu)；基因工程疫苗；研究進(jìn)展；綜述

豬傳染性胃腸炎 （Transmissible gastro enteritis，TGE）是豬的一種高度接觸性腸道疾病，以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉和脫水為特征。各種年齡豬均可發(fā)病，2周齡以內(nèi)仔豬病死率高達(dá)100%，5周齡以上豬的病死率較低，成年豬幾乎沒有死亡。1946年首次由Doyle和Hutchings在美國(guó)報(bào)道發(fā)生TGE，1956年的日本和1957年的英國(guó)也先后報(bào)道該病，隨后歐洲、北美、亞洲等多個(gè)國(guó)家相繼報(bào)道，TGE已成為豬一種世界性疾病。中國(guó)從60年代開始就有TGE的報(bào)道，近些年該病有進(jìn)一步擴(kuò)大流行趨勢(shì)，尤其是冬季和早春寒冷季節(jié)常呈地方性暴發(fā)流行，TGE仍是現(xiàn)今引起仔豬發(fā)病和死亡的主要原因之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成極大困擾[1,2]。在 《國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生法典》中，TGE已經(jīng)被列入國(guó)家B類傳染病，是我國(guó)法定重點(diǎn)防控的疫病之一。

1 基因組結(jié)構(gòu)

TGEV基因組為不分段的單股正鏈RNA，其5’端有帽子結(jié)構(gòu)，3’端有poly（A）尾，基因組與核蛋白相結(jié)合，具有感染性。整個(gè)基因組全長(zhǎng)約為2.85×104bp，分子質(zhì)量為6×103ku，分為7個(gè)區(qū)，每個(gè)區(qū)有一個(gè)或兩個(gè)開放閱讀框（ORFs），亞基因組mRNAs之間有保守序列將其分開，基因組結(jié)構(gòu)為5’-ORF1a-ORF1b-S（ORF2）-ORF3a-ORF3b-sM（ORF4） -M （ORF5） -N （ORF6） -ORF7-3’ 。 ORF2、ORF4、ORF5和ORF6分別編碼病毒的纖突 （S）蛋白、小膜（sM） 蛋白、 膜 （M） 蛋白和核衣殼 （N） 蛋白[3]，ORF1a和ORF1b編碼病毒的聚合酶。ORF1a上游有一個(gè)3個(gè)密碼子長(zhǎng)的ORF （upstream ORF，uORF）， 對(duì)ORF1a和ORF1b轉(zhuǎn)譯起調(diào)控作用，最大的非編碼區(qū)為位于3’端ORF7基因下游不含poly（A）的280個(gè)核苷酸。研究表明，TGEV基因組具有很高的重組率，這一現(xiàn)象類似于分節(jié)段的RNA病毒[4,5]。

2 疫苗研究進(jìn)展

由冠狀病毒引發(fā)的TGE感染，目前仍缺乏有效的臨床藥物，采用疫苗進(jìn)行免疫接種是主要的預(yù)防措施。多年來，研究人員一直致力于TGEV的免疫控制技術(shù)研究，期間大致經(jīng)歷了強(qiáng)毒疫苗、弱毒疫苗、滅活疫苗和基因工程疫苗四個(gè)階段。

2.1 強(qiáng)毒疫苗

TGE具有高度傳染性，一旦爆發(fā)此病，可造成新生仔豬100%死亡，損失極其嚴(yán)重。最初人們采用發(fā)病豬的腸內(nèi)容物和糞便感染全場(chǎng)妊娠母豬使其產(chǎn)生免疫力，從而使仔豬獲得顯著保護(hù)率。Moxley等曾采用以強(qiáng)毒人工免疫方法免疫仔豬，感染仔豬死亡率明顯降低。但該法使豬場(chǎng)場(chǎng)地嚴(yán)重污染，強(qiáng)毒持續(xù)存在，腹瀉發(fā)病率雖降低，但常年發(fā)病，此法現(xiàn)已被禁止。

2.2 滅活疫苗

2007年，賈華強(qiáng)分離到TB（中國(guó)豬傳染性胃腸炎病毒株強(qiáng)毒株），適應(yīng)細(xì)胞后用低代次毒的細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)甲醛滅活后，分別制備了油包水乳化苗和氫氧化鋁吸附苗，豬體試驗(yàn)結(jié)果顯示豬體保護(hù)率超過80%[6]。滅活疫苗雖然安全有效，但其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答產(chǎn)生較慢 （15d左右），且不能激發(fā)產(chǎn)生以slgA抗體為主的粘膜免疫反應(yīng)，制苗成本比較昂貴。

2.3 弱毒疫苗

TGEV弱毒疫苗主要包括北美TGE-VAC、匈牙利CKP和日本TO-163疫苗株[7]。該疫苗對(duì)TGE預(yù)防工作起到了重要作用，能刺激產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)，肌注產(chǎn)生抗體快、水平高，歐美主要使用弱毒疫苗。國(guó)外學(xué)者Aynaud將TGEV突變株188-SG致弱分別通過口服、肌肉注射、眼結(jié)膜途徑免疫妊娠母豬，從而使哺乳仔豬得到保護(hù)。但TGEV弱毒疫苗同樣具有其他弱毒疫苗所存在的易凡返祖、有潛在感染危險(xiǎn)等缺陷。臨床上將弱毒苗和滅活苗一起使用，可產(chǎn)生較好的保護(hù)效果。

2.4 基因工程疫苗

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基因工程疫苗以成本低、生產(chǎn)簡(jiǎn)單、存儲(chǔ)方便等優(yōu)勢(shì)倍受人們青睞，各種TGEV基因工程疫苗的研究得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。完整的TGEV包含4種結(jié)構(gòu)蛋白，纖突蛋白 （S）、小膜 （sM）蛋白、膜（M）蛋白和核衣殼 （N）。纖突蛋白 （S）和N蛋白是目前TGE基因工程疫苗的研究靶點(diǎn)。

2.4.1 亞單位疫苗

亞單位疫苗中含有特殊的高分子，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抵抗病原體的免疫保護(hù)作用，從而產(chǎn)生良好的免疫效果。由于TGE冠狀病毒的S蛋白具有良好的免疫原性和腸道內(nèi)較強(qiáng)的抗降解能力，因此它成為發(fā)展哺乳動(dòng)物腸道病原體口服疫苗非常好的模型。2004年，Streatfield等人以谷物作為載體表達(dá)TGEV S蛋白，制備的亞單位疫苗可有效提高母豬血清以及初乳的中和抗體水平，提高了免疫效果[8]。

2.4.2 核酸疫苗

核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因直接導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中表達(dá)并合成抗原蛋白，激起抗體一系列類似于疫苗接種的免疫應(yīng)答，起到預(yù)防和治療疾病的目的。具有易于制備、可塑性大、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，并能使疫苗抗原在靶細(xì)胞內(nèi)以天然的方式合成加工后遞呈給免疫系統(tǒng)，被譽(yù)為第三次疫苗的革命。

2.4.3 重組活載體疫苗

活載體疫苗是近年來研究熱點(diǎn)之一，制苗時(shí)將外源保護(hù)性目的基因插入活載體中，構(gòu)成活載體基因工程疫苗或稱基因工程重組活疫苗。該種疫苗可誘導(dǎo)的免疫反應(yīng) （如：體液免疫、細(xì)胞免疫反應(yīng)、粘膜免疫）比較廣泛，還具有成本低及安全性好等優(yōu)點(diǎn)，由于外源基因已經(jīng)作為載體病毒自身結(jié)構(gòu)的一部分，故所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平高于完整病毒相應(yīng)成分所引起的免疫反應(yīng)。

2.4.4 基因缺失疫苗

基因缺失疫苗是使病毒某一基因完全缺失或發(fā)生突變從而使其毒力減弱，感染宿主后誘發(fā)保護(hù)性免疫力反應(yīng)。1997年Ballesteros等人[9]嘗試改變TGEV的S基因214、655位2個(gè)堿基，制成重組基因突變疫苗，進(jìn)行呼吸道和腸道組織感染，結(jié)果表明只改變655位堿基，可對(duì)呼吸道TGEV產(chǎn)生特異性反應(yīng)，只改變219位堿基卻能夠使TGEV腸嗜性發(fā)生缺失。

2.4.5 轉(zhuǎn)基因植物疫苗

轉(zhuǎn)基因植物疫苗是通過植物基因工程技術(shù)與機(jī)體免疫機(jī)理相結(jié)合，將免疫原性基因?qū)胫参镏?，從而獲得有免疫原性蛋白表達(dá)的基因疫苗植株，將轉(zhuǎn)基因植物組織給動(dòng)物飼喂，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的抗原呈遞到動(dòng)物的腸道淋巴組織，被其表面特異受體特別是M細(xì)胞所識(shí)別，產(chǎn)生粘膜免疫和體液免疫反應(yīng)。2002年LamphearBJ等構(gòu)建了表達(dá)S基因的轉(zhuǎn)基因玉米，用轉(zhuǎn)基因玉米種子飼喂豬發(fā)現(xiàn)，機(jī)體產(chǎn)生了保護(hù)性中和抗體，因此轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的TGEV S糖蛋白有經(jīng)口免疫原性，并能激發(fā)機(jī)體較強(qiáng)的粘膜免疫反應(yīng)，有望研究成可飼疫苗。

3 展望

TGEV分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，使結(jié)構(gòu)蛋白、核酸結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)方式及基因工程等方面的研究取得了較大的進(jìn)展，同時(shí)也促進(jìn)了其新型基因工程疫苗的研發(fā)速度。目前由于國(guó)內(nèi)基因工程疫苗的研究起步較晚，還沒有高效的基因工程疫苗投入到生產(chǎn)中，但基因工程疫苗的優(yōu)勢(shì)無可爭(zhēng)議，今后TGEV疫苗的研究重點(diǎn)仍是基因工程疫苗特別是減毒活疫苗的研發(fā)。由于TGE的免疫以局部粘膜免疫為主，被動(dòng)免疫特別是分泌型IgA在本病的預(yù)防中也發(fā)揮著重要作用，已經(jīng)有利用抗體及其衍生物來防控TGE的報(bào)道[10,11]，RNA干擾技術(shù)也被成功用于TGEV防控的研究中[12]且效果顯著，口服疫苗也將是今后研發(fā)的方向之一。

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