徐 玢 張初吉 李建國 于東明 郭 偉

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院急診科，北京100050

高滲鹽水對重癥腦出血的免疫調(diào)節(jié)作用研究

徐 玢 張初吉 李建國 于東明 郭 偉

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院急診科，北京100050

目的探討10%高滲鹽水對重癥腦出血患者的外周血細胞計數(shù)及單核細胞亞群分布的影響。方法將首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院急診科2012年4月～2013年4月收治的重癥腦出血伴有中線移位患者共24例，隨機分為高滲鹽水治療組（HS組）12例和甘露醇治療組（MT組）12例。HS組給予10%氯化鈉溶液50 mL靜脈點滴，30 min輸完；MT組給予20%甘露醇250 mL靜脈點滴，15～20 min內(nèi)輸完。脫水治療開始后0、1、3、6、24 h靜脈采集外周血，進行全血細胞計數(shù)，及流式細胞儀測定血單核細胞CD16、CD14表達水平，兩組患者血細胞計數(shù)值以均數(shù)±標準差（x依s）表示，組間比較使用兩獨立樣本t檢驗，兩組單核細胞亞群表達水平為頻數(shù)資料，組間比較使用χ2檢驗。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果由于應(yīng)激反應(yīng)，兩組患者基線的白細胞計數(shù)均增高，脫水后兩組白細胞總數(shù)和中性粒細胞計數(shù)均有降低，6 h最為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），24 h較前有所回升，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與基線比較，脫水后MT組淋巴細胞計數(shù)降低，3、6 h最為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而HS組無明顯淋巴細胞減少，組間3、6 h差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。脫水治療后，外周血單核細胞亞群出現(xiàn)重新分布。MT組CD14++細胞顯著下降，CD14++CD16+表達顯著增加，而在HS組，CD14++細胞呈中度增加，CD14++CD16+亞群表達卻顯著減少，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論急性重癥腦出血患者應(yīng)用高滲鹽水脫水治療可促進淋巴細胞增殖，減少前炎癥單核細胞CD14++CD16+亞群表達，減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)卒中后的免疫失衡。

腦出血曰高滲鹽水曰免疫曰單核細胞亞群

腦出血因其高病死率及致殘率已成為目前危及人類健康的嚴重疾病之一。腦出血的病情嚴重程度除了和病灶部位和血腫大小有關(guān)外，還和血腫局部的炎性反應(yīng)、凋亡誘導(dǎo)、全身免疫抑制等密切相關(guān)[1-2]。研究顯示，腦出血后繼發(fā)性細胞及體液免疫失衡與出血后并發(fā)癥發(fā)生及病死率直接相關(guān)[3-4]。因此，為了減輕腦功能缺損及減少并發(fā)癥，研究如何維持腦出血后神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)的平衡，也越來越受到關(guān)注。

目前對于腦出血患者進行免疫調(diào)節(jié)治療的臨床報道相對較少，仍處在試驗階段。而有研究顯示，高滲鹽水具有抑制白細胞活化、促進淋巴細胞增殖及抑制早期炎性反應(yīng)等免疫調(diào)節(jié)作用[5-6]。因此，本研究探討重癥腦出血患者，應(yīng)用高滲鹽水脫水治療后，外周血細胞計數(shù)及單核細胞亞群分布的變化。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院急診重癥監(jiān)護病房（EICU）2012年12月～2013年4月急性重癥腦出血患者共24例，其中男15例，女9例；年齡28～70歲，平均（57.6±4.7）歲；格拉斯哥昏迷評分（GCS）3～8分。所有患者均經(jīng)頭顱CT掃描確認，其中出血量20～30 mL有11例，＞30 mL有13例，均伴有中線移位。診斷符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議[7]修訂的診斷標準。采用隨機數(shù)字法，將所有患者分為高滲鹽水治療組（HS組）和甘露醇治療組（MT組），各12例。HS組男9例，女3例；平均年齡（59.7±7.5）歲；其中底節(jié)區(qū)出血8例，腦葉出血2例，腦干及小腦出血2例；血腫體積（36.4±4.8）mL；GCS評分為（6.2±1.3）分。MT組男8例，女4例；平均年齡（60.1±6.9）歲；其中底節(jié)區(qū)出血9例，腦葉出血1例，腦干及小腦出血2例；血腫體積（35.8±5.3）mL；GCS評分為（5.9±1.1）分。兩組性別、年齡、血腫位置、血腫大小、GCS評分等方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本臨床研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準，所有擬入選的研究對象，均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 入選及排除標準

入選標準：年齡大于18歲小于75歲發(fā)病24 h內(nèi)的急性腦出血患者，頭顱CT明確顱內(nèi)出血20 mL以上，中線有移位，GCS評分3～8分。排除標準：①外傷、腫瘤、妊娠；②急性感染，以及最近3個月內(nèi)有感染病史；③自身免疫性疾??；④血鈉高于155 mmol/L，滲透壓高于320 mOsm/L；⑤腎損害（肌酐水平＞601 μmol/L）；⑥心功能不全；⑦慢性肝病。

1.3 終止治療的條件及處理

治療過程中，若患者出現(xiàn)急性心功能不全或腎功能衰竭發(fā)生，立即終止本次治療，并做相應(yīng)處理。

1.4 抗體堯試劑和溶液

異硫氰酸熒光素（FITC）標記的單克隆抗體CD16、CD45，別藻青蛋白（APC）標記的CD14，藻紅蛋白（PE）標記的陰性對照IgG，購自Gibco公司，多聚甲醛購自Sigma公司，流式細胞儀溶血素（fluorescence activated cell sorter lysing solution，F(xiàn)ACS lysing solution）購自美國BD公司，流式細胞儀為美國BD FACS Calibur。10%高滲鹽水及20%甘露醇由醫(yī)院藥房準備。

1.5 試驗方法

HS組脫水治療選用10%高滲鹽水50 mL（脫水治療頻次每8小時1次10例/每6小時1次2例），MT組選用20%甘露醇250 mL脫水治療（脫水治療每8小時1次10例/每6小時1次2例），HS滴注時間為30 min，MT滴注時間15～20 min（均通過鎖骨下深靜脈輸注）。其余遵照腦出血常規(guī)治療。

1.6 血液收集

用處理有乙二胺四乙酸（EDTA）和肝素鈉的玻璃真空管收集血標本，取脫水治療后0、1、3、6、24 h全血兩管各2 mL，一管送檢全血計數(shù)，另一管檢測單核細胞表面CD分子表達。

1.7 外周血單核細胞CD14堯CD16的測定

取2支流式管，各加入50 μL全血，在試管1中加入陰性對照同型IgG檢測非特異性結(jié)合，在試管2中加入抗CD-45-FITC、CD-45-FITC和CD14-APC抗體各10 μL檢測中性粒細胞和單核細胞亞群，輕輕混勻，室溫下避光15 min，然后加入1.5 mL溶血劑，靜置15 min，3000 r/min離心，洗滌后棄上清，用200μL磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline，PBS）液重懸，流式細胞儀檢測細胞表面CD分子表達。

1.8 流式細胞儀分析

先用CD45、CD14圈取單核細胞門，然后進一步設(shè)門鑒別共表達的CD16和CD14的2個主要的單核細胞亞群，即CD14++CD16-亞群和前炎癥單核細胞亞群CD14++CD16+。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

臨床試驗設(shè)計采用隨機對照方法，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x依s）表示，兩獨立樣本的計量資料采用t檢驗；重復(fù)測量的計量資料采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料采用精確概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

24例患者全部納入試驗，治療過程中，未有患者出現(xiàn)急性心功能不全或腎功能衰竭發(fā)生終止試驗，未有電解質(zhì)紊亂、高滲透壓等副作用需要干預(yù)治療病例。

2.1 兩組脫水前后白細胞堯中性粒細胞堯淋巴細胞計數(shù)比較

由于急性腦出血的應(yīng)激反應(yīng)，所有患者基線的白細胞計數(shù)均增高，白細胞分類中以中性粒細胞增多為著。HS組及MT組患者脫水后白細胞計數(shù)和中性粒細胞計數(shù)均有降低，6 h最為明顯，與基線比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），24 h較前有所回升，兩組比較，HS組白細胞計數(shù)低于MT組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；MT組患者脫水后淋巴細胞計數(shù)降低，3、6 h最為明顯，與基線比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），24 h較前有所回升，HS組無明顯淋巴細胞減少，3、6 h組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組脫水前后全血單核細胞計數(shù)及亞群分布

脫水治療后，外周血中典型單核細胞亞群（CD14++CD16-）和前炎癥單核細胞亞群（CD14++CD16+）出現(xiàn)重新分布。與基線比較，HS組和MT組中，大部分單核細胞的仍為典型的CD14++亞群，但MT組CD14++細胞顯著下降，CD14++CD16+表達顯著增加。而在HS組，CD14++細胞呈中度增加，CD14++CD16+亞群表達卻顯著減少。兩組CD14++CD16+單核細胞亞群百分比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

隨著研究報道的不斷增多，近年來腦卒中后的早期免疫過度及后繼的免疫抑制越來越受到關(guān)注。研究顯示，腦出血后患者細胞免疫功能下降，如CD3、CD4 T細胞比例明顯下降，且與病情呈正相關(guān)[8]。同樣，出血性卒中后存在體液免疫反應(yīng)異常，腦出血患者腦脊液中IgG和補體C3水平升高，外周血中分泌細胞因子的白細胞數(shù)量增多，導(dǎo)致血液中細胞因子分泌增多[9-10]。卒中后患者還出現(xiàn)繼發(fā)性紅細胞免疫功能低下，如紅細胞免疫黏附功能下降[11]。而腦出血后血腫周圍腦組織的炎性反應(yīng)更為劇烈，在血腫周圍腦組織存在缺血、炎性反應(yīng)、凋亡等繼發(fā)性損傷。多種細胞因子白細胞介素（IL）-1、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子（TNF）、黏附分子、單核細胞趨化蛋白和血小板源性生長因子等均參與了腦出血后早期血腫周圍腦組織炎性反應(yīng)過程[12]。

單核細胞是調(diào)節(jié)免疫過程中的一種重要細胞群，可直接殺傷病原體或腫瘤細胞，或通過遞呈抗原引起機體免疫應(yīng)答，從而清除“異己”。人的單核細胞表面都表達有脂多糖抗體CD14，依據(jù)是否表達CD16可將其分為經(jīng)典型（CD14++CD16-）、中間型（CD14++CD16+）及非典型（CD14+CD16++）單核細胞[13]。經(jīng)典型占外周血單核細胞總數(shù)的80%～90%，后兩群均占外周血單核細胞總數(shù)的5%～10%。三群單核細胞分別代表不同的分化成熟階段，經(jīng)典型和非典型亞群是單核細胞分化發(fā)育的兩極，分別處于相對低分化和高分化階段，而中間型是連接兩極的過渡地帶，因此也稱為炎癥性單核細胞亞群，它的表型比例失衡與感染及免疫相關(guān)[13]。因此，本研究探討高滲鹽水是否對腦出血患者的單核細胞亞群有免疫調(diào)節(jié)作用。

高滲鹽水開始應(yīng)用于創(chuàng)傷后的液體復(fù)蘇，近年來，作為創(chuàng)傷后顱內(nèi)壓增高時應(yīng)用的滲透性脫水藥物，已越來越受到大家的關(guān)注，對于其安全性及對血流動力學(xué)的影響已有許多的研究，在安全性、降顱壓效果方面均優(yōu)于傳統(tǒng)藥物甘露醇[14]。而同時，有報道顯示，高滲鹽水可減緩炎癥發(fā)生及發(fā)展。體外實驗結(jié)果顯示，高滲鹽水可抑制中性粒細胞的活化和黏附，刺激淋巴細胞增殖，抑制前炎癥因子，刺激單核巨噬細胞產(chǎn)生抗炎因子，減少激素分泌[15-17]。目前關(guān)于高滲鹽水的臨床試驗多針對創(chuàng)傷性休克病例，體內(nèi)試驗提示，高滲鹽水可抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展，減少創(chuàng)傷后血管內(nèi)皮的炎性損傷，尤其對肺組織損傷有保護作用[18]。因此，本研究探討出血性卒中患者應(yīng)用高滲鹽水后的免疫變化。而作為對照組的脫水藥物甘露醇，并無相關(guān)的免疫作用研究及報道。所以，本研究選取中重度的急性腦出血合并腦疝患者，給予MT或HS脫水治療，觀察兩組的外周血細胞計數(shù)變化，以及單核細胞亞群的再分布。由于高滲鹽水可抑制白細胞的活化，本研究觀察脫水后患者白細胞計數(shù)變化。結(jié)果顯示，MT組和HS組白細胞及中性粒細胞計數(shù)均較基線明顯下降，可能為高滲狀態(tài)使細胞萎縮，激活滲透壓感受器并抑制其他通路傳入對中性粒細胞的激活[18]。雖然HS組的白細胞計數(shù)少于MT組，但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另外，MT組患者脫水后淋巴細胞減少，而HS組的淋巴細胞無明顯變化，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這證實了高滲鹽水可促進淋巴細胞的動員和增殖，與以往的研究結(jié)果相同[10-13]。本研究顯示，腦出血后，外周血中典型單核細胞亞群（CD14++CD16-）和前炎癥單核細胞亞群（CD14++CD16+）出現(xiàn)重新分布。MT組雖然大部分單核細胞的仍為典型的CD14++亞群，但CD14++細胞比例較前明顯下降，前炎癥細胞CD14++CD16+亞群表達顯著增加。這可能是由于細胞膜表面炎癥趨化因子受體表達上調(diào)，因此表現(xiàn)出更強的促炎活性，合成分泌TNF-α、IL-6的能力顯著增強[19]，促進出血后炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。而在HS組，CD14++細胞呈中度增加，CD14++CD16+亞群表達卻顯著減少。比較兩組CD14++CD16+亞群百分比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果提示，腦出血后單核細胞CD14++CD16+亞群出現(xiàn)明顯的增殖，而高滲鹽水可選擇性減少此前炎癥細胞亞群的增殖，抑制出血后過度的炎性反應(yīng)。

免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)參與了出血性腦卒中的病理、生理過程，隨著神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌研究的深入，針對出血后免疫功能的變化進行抗炎和免疫調(diào)理治療已引起普遍關(guān)注[20-21]。高滲鹽水既能通過滲透性脫水減輕腦組織水腫，也可通過調(diào)節(jié)腦出血后免疫失衡，減輕炎性反應(yīng)引起的腦水腫，可能成為促進出血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)的一個新的切入點。

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Study on immunomodulatory effects of hypertonic saline for severe in-tracerebral hemorrhage

XU BinZHANG ChujiLI JianguoYU DongmingGUO Wei
Department of Emergency,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University,Beijing100050,China

ObjectiveTo investigate the effect of 10%hypertonic saline(HS)on peripheral blood cells count and distribution of monocytes subpopulations of patients with severe intracerebral hemorrhage.MethodsTwenty-four patients with severe intracerebral hemorrhage and midline shift admitted to Department of Emergency,Beijing Tiantan Hospital,Capital Medical University from April 2012 to April 2013 were randomly divided into:HS group(n=12)and mannitol(MT)group(n=12).Patients in HS group received intravenous administration of 50 mL of 10%sodium chloride within 30 min;MT group received 250 mL of 20%mannitol within 15-20 min.Peripheral blood samples were collected before dehydration treatment,and at 1,3,6,24 h after dehydration treatment,then the samples were measured for blood cell count and monocytes subpopulations including CD16,CD14 were detected by flow cytometer.Data of blood cell count were expressed as mean±standard(x依s),the inter-group comparison was carried out by independent sample ttest.The level of monocytes subpopulations was frequency date,the inter-group comparison was carried out by χ2test. SPSS 13.0 software was used for statistical analysis,P＜0.05 was taken as a statistically significant difference.ResultsThe hemorrhage stroke induced a significant leukocytosis in all patients as evidenced by elevating baseline cell counts. After dehydration,the total leukocyte and neutrophil counts in the two groups were all decreased,especially at 6 h,the difference was statistically significant(P＜0.05),they rose again at 24 h,while there were no significant differences in cell counts between the two groups(P＞0.05).Compared with the baseline,the lymphocyte count of MT group after dehydration was reduced,especially at 3,6 h,the difference was statistically significant(P＜0.05),while HS group showed no significant reduction of lymphocyte count, therewerestatisticallysignificantdifferencesof lymphocyte count after dehydration for 3,6 h between the two groups(P＜0.05).After dehydration,peripheralblood monocyte subsets showed redistribution.Cells of CD14++in MT group was reduced and the expression of CD14++CD16+was increased,while in HS group,cells of CD14++was moderately increased,and the expression of CD14++CD16+was reduced,there were significant differences between the two groups(P＜0.05).ConclusionApplication of HS for dehydration treatment in patients with acute severe intracerebral hemorrhage can promote lymphopoiesis,inhibit the expression of“pro-inflammatory”CD14++CD16+subsets,reduce the inflammatory response and adjust the immune imbalance after stroke.

Intracerebral hemorrhage;Hypertonic sodium;Immunology;Monocytes subpopulation

R743.34

A

1673-7210（2015）04（b）-0088-05

2014-12-29本文編輯：張瑜杰）

徐玢（1972.8-），女，碩士研究生，副主任醫(yī)師；研究方向：細胞生物。

郭偉（1972.7-），男，博士，副主任醫(yī)師；研究方向：呼吸內(nèi)科。