孫艷（湖北省潛江市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 433199）

加強(qiáng)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室建設(shè) 提高服務(wù)水平

孫艷（湖北省潛江市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 433199）

獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室不僅要利用血清學(xué)、流行病學(xué)等技術(shù)手段對(duì)動(dòng)物疫病進(jìn)行檢測(cè)和分析，還必須通過(guò)細(xì)菌的分離和培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)以及病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)對(duì)動(dòng)物疫病進(jìn)行確診，只有防治結(jié)合，才能更好的為畜牧業(yè)服務(wù)。

獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室；檢測(cè)分析；病原學(xué)檢測(cè)；服務(wù)

近年來(lái)，隨著國(guó)家動(dòng)物疫病檢測(cè)計(jì)劃的實(shí)施，獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。實(shí)驗(yàn)室能利用血清學(xué)、流行病學(xué)等技術(shù)手段對(duì)動(dòng)物疫病進(jìn)行檢測(cè)和診斷，為政府部門和養(yǎng)殖企業(yè)提供準(zhǔn)確、快速的疫病檢測(cè)數(shù)據(jù)和分析報(bào)告，協(xié)助制訂科學(xué)的防治政策和建立有效的疫病控制計(jì)劃與凈化措施，為動(dòng)物疫病控制和疫情處理的決策提供科學(xué)、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)依據(jù)，為動(dòng)物疫病的疫情預(yù)報(bào)預(yù)警、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和免疫效果評(píng)價(jià)提供科學(xué)數(shù)據(jù)，提高潛江市對(duì)重大動(dòng)物疫病早期預(yù)警預(yù)報(bào)能力，動(dòng)物疫病與畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的追蹤溯源能力，處理緊急重大動(dòng)物疫情和突發(fā)動(dòng)物公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急反應(yīng)能力，保障潛江市畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展，保護(hù)人民身體健康。

1 獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)狀

1.1 實(shí)驗(yàn)室基本情況

本中心實(shí)驗(yàn)室建筑面積320m2，屬于生物安全一級(jí)實(shí)驗(yàn)室。中心實(shí)驗(yàn)室設(shè)有解剖室、檔案室和樣品保存室、儀器室、洗滌消毒室、血清學(xué)檢測(cè)室，主要負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)業(yè)務(wù)的受理、樣品處理和保存、流行病學(xué)調(diào)查和分析及日常管理工作。

1.2 實(shí)驗(yàn)室工作人員情況

中心實(shí)驗(yàn)室共有專業(yè)技術(shù)人員3名，其中高級(jí)獸醫(yī)師2名，中級(jí)獸醫(yī)師1名。

1.3 實(shí)驗(yàn)室開展檢測(cè)項(xiàng)目

目前實(shí)驗(yàn)室以抗體檢測(cè)為主，開展了豬瘟ELISA試驗(yàn)、豬（牛）口蹄疫間接血凝試驗(yàn)、雞新城疫和禽流感血凝與血凝抑制試驗(yàn)、布氏桿菌玻板凝集試驗(yàn)和血吸蟲金標(biāo)免疫試驗(yàn)。2014年本中心監(jiān)測(cè)計(jì)劃：豬瘟檢測(cè)1320份、口蹄疫檢測(cè)1760份、禽流感檢測(cè)4360份、新城疫檢測(cè)440份、血吸蟲病檢測(cè)6740份以及布氏桿菌病1000份。

2 提高縣級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室診斷能力

正確合理的運(yùn)用抗體檢測(cè)技術(shù)，能指導(dǎo)我們正確地及時(shí)地進(jìn)行防疫工作，可為某些疫病的診斷提供必要的依據(jù)，但是存在一定的局限性。隨著畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，畜禽集約化飼養(yǎng)程度不斷提高，飼養(yǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大，飼養(yǎng)密度不斷增加，產(chǎn)品交流更加頻繁，動(dòng)物疫病已成為制約畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的主要因素之一。如果發(fā)生了疫病，我們就必須進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷和治療，只有防治結(jié)合，才能更好的為潛江市畜牧業(yè)服務(wù)。

2.1 細(xì)菌的分離、培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基是指在人工培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，提供給細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的制品?；A(chǔ)培養(yǎng)基中所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能滿足一般病原菌生長(zhǎng)繁殖所需的氮源、碳源和無(wú)機(jī)鹽等。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加一些特殊成分（如糖類、血液、抑制劑等）則可制成營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基等。下面僅介紹普通瓊脂培養(yǎng)基和血液瓊脂培養(yǎng)基的制備。

2.1.1.1 普通瓊脂培養(yǎng)基

普通瓊脂培養(yǎng)基是常用的固體培養(yǎng)基，包括普通瓊脂平板和普通瓊脂斜面兩種，前者用于分離純種細(xì)菌，后者用于增殖純種細(xì)菌或保存菌種。材料：①肉水：200ml；②蛋白胨：2g；③氯化鈉：1g；④瓊脂：5g；⑤無(wú)菌平皿、滅菌試管、三角燒瓶等。方法：①按上述數(shù)量把肉水、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂放到三角燒瓶中，加熱溶化。②趁熱用pH試紙測(cè)酸堿度，用10%碳酸氫鈉校正pH為7.2左右。③15磅高壓蒸汽滅菌20～30min。④趁熱將溶化的培養(yǎng)基倒入滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)平皿倒入約15ml，凝固后即成普通瓊脂平板培養(yǎng)基；如趁熱將培養(yǎng)基倒入滅菌試管內(nèi)，再將試管斜放試驗(yàn)臺(tái)上，凝固后即成普通瓊脂斜面培養(yǎng)基。

2.1.1.2 血液瓊脂培養(yǎng)基

有些細(xì)菌其營(yíng)養(yǎng)要求較高，在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)不良，可用血液瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將滅菌的普通瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，待冷至50℃左右，加入無(wú)菌的脫纖綿羊或家兔鮮血5%（即每100ml普瓊加入鮮血5ml），在50～60℃的水中水浴混合后，倒入滅菌平皿，保存于4℃冰箱備用。

2.1.2 需氧性細(xì)菌分離培養(yǎng)和移植

2.1.2.1 劃線分離培養(yǎng)法

（1）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指將皿蓋揭開呈20度左右的角度；

（2）右手持接種環(huán)，從病料中取少量材料涂布于培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)上多余的材料在火焰上燒毀，待接種環(huán)冷卻后，再與所涂材料的地方輕輕接觸，開始劃線；

（3）劃線中不宜過(guò)多地重復(fù)舊線，以免形成菌苔；

（4）接種完畢，在皿底上作好日期和接種者標(biāo)記，平皿倒扣，置37℃培養(yǎng)24h。

2.1.2.2 純培養(yǎng)的獲得與移植

將劃線分離培養(yǎng)24h的平皿從溫箱取出，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，證明不含雜菌，此時(shí)用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，移植于瓊脂斜面培養(yǎng)，所得到的培養(yǎng)物，即為純培養(yǎng)物。

2.1.3 藥敏試驗(yàn)

（1）于純培養(yǎng)斜面上，挑取相同的菌落4～5個(gè)；

（2）接種于肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)6～8h；

（3）校正菌液濁度，使其與標(biāo)準(zhǔn)比濁管（0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽┑臐舛认嗤?/p>

（4）用無(wú)菌棉拭子取校正過(guò)的菌液，在試管壁上擠壓幾次，壓去多余的菌液，涂布整個(gè)平板表面，多次旋轉(zhuǎn)平板60度，涂布均勻；

（5）在室溫中干燥3～5min后，用無(wú)菌鑷子取藥敏紙片，間距不小于24mm，紙片的中心距平板邊緣不小于15mm；

（6）置35℃孵育18～24h后，用標(biāo)尺量取抑菌圈直徑，直徑越大，對(duì)此藥物越敏感。

2.2 病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

（1）變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈；

（2）退火：（復(fù)性）：溫度降到55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

（3）延伸：模板—引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈；

（4）重復(fù)循環(huán)變性—退火—延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板，每完成一個(gè)循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍；

（5）將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，紫外凝膠成像儀成像觀察結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)清晰目的條帶，陰性對(duì)照無(wú)帶出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。若被檢樣品出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照一樣清晰的條帶，判為陽(yáng)性，否則為陰性。

3 結(jié)論

科學(xué)監(jiān)測(cè)和病原檢測(cè)、準(zhǔn)確分析是保證畜牧業(yè)突破性發(fā)展的基礎(chǔ)，是提前發(fā)現(xiàn)疫情，快速反應(yīng)，減少損失的有效方法。我們要充分發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室資源優(yōu)勢(shì)，提高服務(wù)技能，逐步擴(kuò)大服務(wù)覆蓋面。