劉世霞（山東省沂水縣馬站畜牧獸醫(yī)工作站 276403）

水貂支氣管敗血波氏桿菌的分離鑒定

劉世霞（山東省沂水縣馬站畜牧獸醫(yī)工作站 276403）

支氣管敗血波氏桿菌是廣泛感染多種哺乳動(dòng)物，有時(shí)也感染人的一種常在病原菌。該菌屬于波氏桿菌屬，借其粘附素和毒素對(duì)宿主致病，引起感染動(dòng)物的呼吸道疾病，并協(xié)同其他病原菌形成嚴(yán)重的肺部混合感染，備受人們的廣泛關(guān)注。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來源

山東省沂水縣馬站鎮(zhèn)劉莊水貂養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆瓊脂（由北京中海生物科技有限公司生產(chǎn)），肉湯瓊脂（由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)），血液培養(yǎng)基、普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司），瓊脂粉（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

1.1.3 相關(guān)試劑

波氏菌屬細(xì)菌生化編碼鑒定管（購自上海土鋒生物科技有限公司），快速革蘭氏染色液試劑（購自濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司）。

1.1.4 藥敏試驗(yàn)紙片

藥敏試紙片（杭州天和微生物試劑有限公司）。

1.1.5 試驗(yàn)動(dòng)物

10日齡SPF雞胚6枚，2日齡雛雞6只，19～23g小白鼠6只，均由臨沂大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)儀器和器材

1.2.1 試驗(yàn)儀器

DY04-13-44-00壓力蒸汽滅菌器桶，SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，SW-WJ-LCU潔凈工作臺(tái)，恒溫箱，照蛋器，SA3000PL光學(xué)顯微鏡，F(xiàn)T-XFC3孵化箱，電子天平，電熱爐（中國(guó)龍口市先科儀器公司）。

1.2.2 玻璃器材

試管、培養(yǎng)皿、燒杯、量筒、250ml錐形瓶、300ml錐形瓶、玻璃棒、酒精燈。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基制備的基本方法：稱量→溶解→分裝→滅菌→備用。

2.1.1 麥康凱培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱取13.5g麥康凱瓊脂，溶于盛有250ml蒸餾水的錐形瓶中，在電熱爐上加熱攪拌至完全溶解。取10個(gè)洗凈烘干的培養(yǎng)皿，進(jìn)行分裝，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入20ml麥康凱瓊脂溶液。采用高壓蒸汽滅菌法，在103.4kPa的蒸汽壓下121℃加熱20min對(duì)初步配置的麥康凱培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，冷卻備用。

2.1.2 半固體培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱取3.8gTSA瓊脂，溶于盛有100ml蒸餾水的錐形瓶中，再向錐形瓶中加入0.5g的瓊脂粉，在電熱爐上加熱攪拌至完全溶解。取10個(gè)洗凈烘干的試管，進(jìn)行分裝，每個(gè)試管倒入5ml溶液，高壓蒸汽滅菌，方法同上。

2.1.3 血液培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱取9.5gTSA瓊脂，溶于盛有200ml蒸餾水的錐形瓶中，在電熱爐上加熱攪拌至完全溶解，高壓滅菌后待用。取試驗(yàn)兔子，無菌心臟采血后立即注入裝有玻璃珠的滅菌瓶中，緩慢搖動(dòng)，進(jìn)行脫纖維處理。取20ml脫纖無菌血倒入已溶解的TSA錐形瓶中。進(jìn)行分裝，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入20ml加入了脫纖血的TSA溶液。避免污染，冷卻待用。

2.1.4 肉湯培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱取1.5g肉湯瓊脂，溶于盛有50ml蒸餾水的錐形瓶中，加熱攪拌至完全溶解。分裝，每個(gè)試管倒入5ml溶解的肉湯瓊脂，高壓蒸汽滅菌，備用。

2.1.5 普通瓊脂培養(yǎng)基的制備

用電子天平稱取13.5g普通瓊脂粉，溶于盛有200ml蒸餾水的錐形瓶中，在電熱爐上邊加熱邊攪拌至完全溶解。取洗凈烘干的培養(yǎng)皿，進(jìn)行分裝，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入20ml普通瓊脂溶液。采用高壓蒸汽滅菌法，在103.4kPa的蒸汽壓下121℃加熱20min對(duì)初步配置的普通瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，冷卻備用。

2.2 涂片和染色

接種環(huán)滅菌后無菌操作取水貂氣管環(huán)內(nèi)容物，置于2ml營(yíng)養(yǎng)肉湯試管中，37℃生化培養(yǎng)箱中增菌24h。取無菌潔凈的載玻片一張，接種環(huán)火焰滅菌后取2環(huán)營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，制成直徑為1cm的涂片，經(jīng)火焰干燥固定，進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡油鏡鏡檢。

2.3 分離培養(yǎng)和觀察

無菌操作取細(xì)菌肉湯培養(yǎng)液，采用平板分區(qū)劃線法接種至血平板，置于37℃恒溫箱培育24h，觀察菌落形態(tài)。挑取單個(gè)可疑菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基，至于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)36h，觀察結(jié)果。

2.4 運(yùn)動(dòng)性觀察

在潔凈工作臺(tái)上用滅菌的接種針分別挑取血液培養(yǎng)基可疑菌落，垂直穿入半固體培養(yǎng)基中心接近試管底部，然后迅速沿原路退出，滅菌接種針，將試管至于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

2.5 生化試驗(yàn)檢測(cè)

從血液培養(yǎng)基中挑取可疑單個(gè)菌落，接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、過氧化氫酶、氧化酶、枸櫞酸鹽、甘露醇、氰基質(zhì)、還原硝酸鹽、尿素酶、木糖，山梨醇，硫化氫，維培二氏試驗(yàn)（VP試驗(yàn)），甲基紅（MR）微量生化反應(yīng)試管，至于37℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后觀察生化反應(yīng)結(jié)果。

2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

2.6.1 雞胚接種

取6個(gè)10日齡雞胚，隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組3只。用照蛋器照蛋，用鉛筆劃出氣室和接種的位置，應(yīng)避開雞胚大血管，遠(yuǎn)離胚胎側(cè)氣室邊緣。試驗(yàn)組每個(gè)雞胚尿囊腔接種菌懸濃度為4×1010CFU/ml的細(xì)菌肉湯培養(yǎng)液0.3ml，對(duì)照組每只注射0.3ml滅菌的生理鹽水，完成后用融化的蠟封住接種孔，置于恒溫孵化箱中，孵化3d。

2.6.2 雛雞接種

取6個(gè)2日齡雛雞隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)組的雛雞每只腹腔注射菌懸濃度為4×1010CFU/ml的細(xì)菌肉湯培養(yǎng)液0.5ml；對(duì)照組的每只雛雞僅腹腔注射0.5ml的無菌肉湯培養(yǎng)液。

2.6.3 小白鼠接種試驗(yàn)

取6只20g左右的小白鼠隨機(jī)分成試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)組小白鼠每只腹腔注射菌懸濃度為4×1010CFU/ml的細(xì)菌肉湯培養(yǎng)液0.5ml；對(duì)照組的每只小白鼠腹腔注射0.5ml的無菌肉湯培養(yǎng)液。

2.7 藥物敏感性試驗(yàn)

按照World Health Organization推薦的Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法（K-B法）對(duì)細(xì)菌進(jìn)行的敏感性試驗(yàn)。以涂布法接種分離的菌株，采用無菌吸管吸取24h細(xì)菌肉湯培養(yǎng)液0.2ml，滴在普通瓊脂平板表面的中央位置，用無菌涂棒將細(xì)菌懸液沿各個(gè)方向涂布均勻，室溫下放置5min，使細(xì)菌液充分吸附培養(yǎng)基。取慶大霉素、青霉素、氟哌酸、四環(huán)素、萬古霉素、卡那霉素、克林霉素、左氧氟沙星、丁胺卡那霉素、乙酰甲喹、環(huán)丙沙星藥敏紙片貼在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，測(cè)量抑菌圈直徑。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)，按LS 2001年版的規(guī)定執(zhí)行。

3 試驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 臨床癥狀與病理剖檢診斷結(jié)果

病貂表現(xiàn)食欲減退，甚至廢絕，流鼻液，咳嗽的呼吸道癥狀。解剖后可見呼吸道有膿性粘液，呈淡黃色，肺臟表面有大小不一的化膿灶，肺水腫出血淤血。符合支氣管敗血波氏桿菌的致病特征。

3.2 涂片染色觀察結(jié)果

經(jīng)顯微鏡鏡檢，分離菌為革蘭氏陰性兩端鈍圓的桿菌，短小，少數(shù)成對(duì)存在，大多單在分散，有的成對(duì)存在，未發(fā)現(xiàn)芽孢。符合支氣管敗血波氏桿菌的形態(tài)特征。

3.3 分離培養(yǎng)的結(jié)果

在普通瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，形成灰白色、濕潤(rùn)、邊緣整齊、沿劃線生長(zhǎng)的光滑型菌落，中等大??；在麥康凱培養(yǎng)基上菌落未變紅，形成灰白色、微隆起、圓形、致密、光滑濕潤(rùn)的小菌落；在兔血液培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，菌落生長(zhǎng)較旺盛，呈β溶血，形成圓形、隆起、光滑、灰色的中等大菌落。

3.4 運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)結(jié)果

分離菌沿穿刺線向四周生長(zhǎng)，呈試管刷狀，表明菌體具有運(yùn)動(dòng)能力。

3.5 生化試驗(yàn)的結(jié)果

分離菌不發(fā)酵任何糖類，不分解碳水化合物，MR、VP和吲哚試驗(yàn)陰性，氧化酶、觸酶陽性，尿酶陽性，符合支氣管敗血波氏桿菌的生化試驗(yàn)特性。

3.6 雞胚接種結(jié)果

試驗(yàn)組雞胚孵化箱孵化3d后全部死亡，健康組和對(duì)照組無異常。對(duì)死亡雞胚進(jìn)行剖檢，觀察符合支氣管敗血波氏桿菌的致病特征。

3.7 雛雞接種結(jié)果

試驗(yàn)組雛雞全部死亡，對(duì)試驗(yàn)組進(jìn)行剖檢觀察，可見腸道粘膜出血，小腸有臌氣，腎、脾均有出血點(diǎn)，皮下有粘稠的紅色液體滲出。對(duì)照組雛雞健康存活，均無異常變化。符合支氣管敗血波氏桿菌的致病特征。

3.8 小白鼠接種結(jié)果

試驗(yàn)組小白鼠全部死亡，對(duì)試驗(yàn)組小鼠進(jìn)行剖檢觀察，可見腸道粘膜出血，小腸有臌氣，腎、脾均有出血點(diǎn)，皮下有粘稠的紅色液體滲出。對(duì)照組小白鼠健康存活，均無異常變化。符合支氣管敗血波氏桿菌的致病特征。

3.9 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

分離菌對(duì)于慶大霉素、丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星高度敏感，抑菌效果良好；對(duì)于氟哌酸、四環(huán)素、左氧氟沙星中度敏感；而對(duì)青霉素、萬古霉素、克林霉素、菌痢凈的敏感性較差。臨床用藥應(yīng)優(yōu)先考慮慶大霉素、丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星3種藥物。

4 討論

（1）波氏桿菌病的發(fā)生與環(huán)境因素相關(guān)性很大，因此，為了防控支氣管敗血波氏桿菌在水貂群中感染，首先必須加強(qiáng)貂群飼養(yǎng)管理，做好衛(wèi)生清理工作，定期消毒，提高水貂對(duì)病原體的抵抗力。

（2）發(fā)病時(shí)可選用藥物治療，通過藥敏試驗(yàn)，慶大霉素、丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星藥物效果良好，但臨床用藥時(shí)應(yīng)注意輪換用藥和聯(lián)合用藥，避免獲得性耐藥性的產(chǎn)生。

（3）由于波氏桿菌很容易發(fā)生菌相變異，麥康凱培養(yǎng)基初次培養(yǎng)24h產(chǎn)生的光滑型菌落，再經(jīng)生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，部分光滑型菌落變?yōu)榇植谛途洹?/p>

（4）建立無水貂支氣管敗血性波氏桿菌的貂群。引種和合群前一定要做好病原的檢測(cè)，水貂一旦發(fā)病應(yīng)及時(shí)妥善處