沙德軍（四川省鹽邊縣紅果彝族鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站 617100）

焦萬(wàn)洪（四川省鹽邊縣農(nóng)牧局畜牧站 617100）

李莉（四川省鹽邊縣桐子林鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 617100）

A型流感病毒致病分子機(jī)制及禽流感診斷

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禽流行性感冒是由A型流感病毒引起的從呼吸系統(tǒng)病變到全身敗血癥的一種高度急性傳染病，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。

1 禽流感病毒感染和致病的分子機(jī)制

1.1 吸附、穿膜和脫殼

病毒粒子血凝素突起識(shí)別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面含唾液酸的特異性受體，使病毒與宿主細(xì)胞接觸并吸附到細(xì)胞膜上，然后被吞入，形成胞飲泡，胞飲泡與溶酶體融合使胞內(nèi)pH降到5，病毒粒子血凝素蛋白構(gòu)型改變使位于輕鏈HA2N端的融合序列暴露，引起病毒囊膜與細(xì)胞膜融合，使病毒粒子內(nèi)部的核衣殼釋放到胞漿內(nèi)。

1.2 基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制

病毒脫去囊膜后其核酸片段進(jìn)入宿主細(xì)胞核。首先，病毒RNA聚合酶結(jié)合到宿主mRNA的5′端，通過(guò)聚合酶組分2的核酸內(nèi)切酶活性切下11個(gè)核苷酸，這一序列帶有帽狀結(jié)構(gòu)，可直接作為引物。引物加上后，聚合酶組分1以病毒RNA為模板催化合成起始，并使鏈延伸。接上去的第一個(gè)核苷酸是G，它與病毒RNA聚合酶的3′端第二個(gè)核苷酸互補(bǔ)，病毒轉(zhuǎn)錄酶不轉(zhuǎn)錄3′端的第一個(gè)核苷酸（U）。當(dāng)鏈延伸到14個(gè)核苷酸長(zhǎng)度時(shí)，引物被釋放下來(lái)，但3′端的A仍保留在mRNA上，病毒mRNA的5′端仍為AGC。當(dāng)鏈延伸到近5′端的poly（U）時(shí)，以此為模板合成poly（A）尾后終止鏈的延伸。因此，病毒mRNA是病毒RNA的不完全轉(zhuǎn)錄物。6個(gè)單順?lè)醋觤RNA在核內(nèi)合成后，很快轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿翻譯病毒蛋白。

1.3 病毒蛋白的合成

mRNA在核內(nèi)合成后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿，在核糖體上翻譯成為病毒血凝素、神經(jīng)氨酸酶、核蛋白、聚合酶組分1、聚合酶組分2和聚合酶組分PA。NS和M基因的mRNA分別進(jìn)行剪接，各產(chǎn)生兩個(gè)mRNA，翻譯成非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2，和基質(zhì)蛋白M1、M2。血凝素HA和神經(jīng)氨酸酶NA在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)進(jìn)行糖基化，在高爾基體中修飾后運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜。

1.4 病毒粒子的裝配

首先，HA和NA插入到細(xì)胞膜，然后M1移向細(xì)胞漿膜的內(nèi)側(cè)面，非連續(xù)地貼補(bǔ)使之增厚。NP在細(xì)胞漿合成后首先以游離狀態(tài)存在，但很快進(jìn)入細(xì)胞核并與新合成的vRNA結(jié)合形成核衣殼。8個(gè)基因節(jié)段和內(nèi)部病毒蛋白（NP、PB1、PB2、PA、M2）一起組裝，并移送到有HA、NA和M2插入的細(xì)胞膜位置，準(zhǔn)備出芽。

1.5 病毒的出芽和釋放

這個(gè)過(guò)程可持續(xù)數(shù)小時(shí)而不溶解感染的細(xì)胞，目前機(jī)制尚不清楚。M1合成后到達(dá)細(xì)胞膜并與HA、NA或M2的胞漿區(qū)之間相互作用可能是出芽的信號(hào)。NA去除病毒囊膜上的唾液酸，避免子代病毒在細(xì)胞膜上的吸附聚集，從而促進(jìn)病毒粒子的釋放。病毒成熟的最后一步是靠宿主的蛋白酶將HA裂解為HA1和HA2，使病毒粒子具有感染性并進(jìn)入新一輪的復(fù)制，這個(gè)裂解過(guò)程可能在胞外完成。

2 禽流感的診斷

因?yàn)榍萘鞲衼喰捅姸?，毒力差別很大，臨床癥狀也千差萬(wàn)別，高致病性禽流感除了具有大流行的特點(diǎn)外，很難與其它傳染病區(qū)分，因此單靠臨床診斷常常難以定性。AIV的確切診斷有賴于病毒的分離和鑒定。

2.1 病毒的分離

病毒通常在消化道內(nèi)復(fù)制，所以一般從活禽或死禽的氣管和泄殖腔中分離病毒。消化道和呼吸道的組織、分泌物、排泄物也都適合于分離病毒。在高致病性AIV造成全身感染的條件下，由于嚴(yán)重的病毒血癥，實(shí)際上每一器官都能分離到病毒。

臨床上分離病毒的方法常用棉拭子取氣管和泄殖腔內(nèi)的分泌物，再將棉拭子放在含有抗生素的平衡鹽溶液中，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。雞胚接種是目前分離病毒的常用方法。也可收集器官并放在滅菌的小瓶中，在對(duì)器官進(jìn)行取樣時(shí)，應(yīng)盡量把不同臟器的樣品分別收集，因?yàn)閺膬?nèi)臟器官分離到流感病毒通常意味著全身感染，這常與致病性高致病性禽流感有關(guān)。

2.2 病毒的鑒定

用雞紅細(xì)胞檢測(cè)雞胚尿囊液的血凝活性是鑒定禽流感的方法之一，有常量和微量?jī)煞N技術(shù)。

HA表面抗原亞型的鑒定可在血凝抑制試驗(yàn)（HI）中用一組目前已知的16種（H1～H16）不同血凝素的抗血清來(lái)鑒定HA的亞型?？笻A血清最好用純化的HA蛋白制備，或用單克隆抗體，這樣可以避免由于抗NA抗體所產(chǎn)生的空間干擾。但是，用已知亞型的抗HA抗體不能檢測(cè)含有新的HA亞型的流感病毒。血凝陽(yáng)性的病毒尿囊液還應(yīng)當(dāng)與新城疫病毒感染所引起的血凝活性區(qū)別。

NA亞型通常用制備的9種已知神經(jīng)氨酸酶的抗血清做神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NI）來(lái)鑒定。現(xiàn)已經(jīng)研制出微量NI技術(shù)，這有助于對(duì)大量分離物的分析，并且易于操作。

對(duì)于AIV的毒力鑒定，OIE認(rèn)為，用1：10倍稀釋具有感染性的雞胚尿囊液，靜脈注射8羽4～8周齡的易感雞，每羽0.2ml，若10d內(nèi)致死6～8羽，則這樣的流感病毒為高致病性AIV。

2.3 血清學(xué)診斷方法

用血清學(xué)方法檢測(cè)感染雞抗體的存在，一般在病毒感染7～10d后就可以檢測(cè)到抗體。常用的檢測(cè)抗體的技術(shù)包括HI試驗(yàn)、瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)（AGIP）、病毒中和試驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)（NI）、單輻射溶血試驗(yàn)（SRD）、放射免疫試驗(yàn)（RIA）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。