陳 烜,侯玉立,李偉榮,張 棟,何芙蓉

血漿miRNAs在急性病理期缺血性腦卒中的表達譜分析

陳 烜1,侯玉立2,李偉榮3,張 棟4,何芙蓉3

目的探討缺血性卒中在病理分期的急性期(24 h內)外周血漿中miRNA的表達及臨床意義。方法選取急性腦梗死患者和健康對照者各5例。收集急性腦梗死患者發(fā)病24 h之內的血漿和健康對照者的清晨空腹血漿。采用TaqManmicroRNA Arrays進行miRNAs表達譜篩選。使用相關統(tǒng)計學軟件及統(tǒng)計方法進行數(shù)據分析。結果與健康對照組相比,在缺血性腦卒中發(fā)病24 h內外周血漿中存在差異表達的miRNA。本研究共檢測有統(tǒng)計意義的顯著差異表達的miRNA 66個,其中表達上調的39個,下調的27個。上下調倍數(shù)變化最顯著的miR 4498上調7.84倍(foldchange=7.84),miR 676-5P下調為0.167(fold change= 0.167),P均<0.05。結論急性缺血性腦卒中發(fā)病24 h內外周血漿中即存在差異表達的miRNA,這些差異表達miRNA可能與缺血性卒中早期的缺血缺氧應激,血腦屏障破壞,早期再灌注損傷等有關,也有可能作為缺血性卒中早期干預新的治療方向和靶點。

缺血性卒中;急性病理期;血漿miRNA

缺血性腦卒中是危及我國人民健康的高發(fā)疾病,目前已有治療方法對缺血性卒中發(fā)病急性期積極干預,但缺血性卒中的致殘率仍很高。微小RNA(m-i croRNA,miRNA)是目前生命科學研究領域的焦點[1],可以通過與靶mRNA完全或不完全互補配對的方式在轉錄后負向調控靶mRNA表達,參與了許多疾病的病理生理過程,外周血漿中存在可以反映疾病變化的miRNA[2]。本研究使用基因芯片技術,研究miRNA在急性缺血性卒中24 h內與健康對照比較外周血漿中miRNA的變化,旨在建立缺血性卒中發(fā)病急性期內的外周血漿表達譜,初步篩查在急性缺血性卒中早期起調控作用的miRNA,為急性缺血性卒中的早期治療干預提供新的思路和潛在的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 急性腦梗死患者5例,為太原市中心醫(yī)院神經內科收住的急性缺血性卒中患者。所有患者符合1995年第四屆全國腦血管病學術會議修訂的診斷標準,均經詳細的神經系統(tǒng)檢查及頭顱MRI影像學檢查確診。排除自身免疫性疾病,惡性腫瘤、高熱、呼吸系統(tǒng)疾病等。對照組為5名健康志愿者,年齡、性別比例與患者相匹配。本研究所有標本的獲取均經研究對象同意。

1.2 試劑與儀器 總RNA的提取采用TRIzol(Invitrogen)和miRNeasy mini kit試劑盒提取(Qiagen公司);使用microRNA miRCURYTmLNAArray(version 18.0)基因芯片篩選差異表達miRNA(丹麥Exiqon公司)

1.3 標本收集 5例急性缺血性卒中患者收集急性發(fā)病24 h外周靜脈血。同時收集5名健康志愿者血漿。所有樣本于清晨空腹采集。使用EDTA抗凝管收集外周靜脈血6 mL,并輕輕上下顛倒混勻至于4℃冰箱保存,在1 h之內進行血漿分離。4℃2 000×g離心10min,取上層血漿移至1.5mL無RNA酶(RNasefree)離心管中。4℃1 600×g離心5 min,吸取上層漿至2 mL旋蓋尖底無RNA酶(RNase-free)離心管中;裝好置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 血漿總RNA的提取和質控 采用TRIzo l(Invitrogen)和miRNeasy minikit試劑盒(Qiagen公司)提取RNA。提取的RNA進行質量檢測,使用紫外吸收測定法Nanod rop TM分光記錄儀會自動完成所檢測RNA樣品的質量,記錄OD260/OD280二者比值。

1.5 miRNA芯片標記、雜交 使用microRNA miRCURYTmLNAArray(version 18.0)基因芯片篩選差異表達miRNA(丹麥Exiqon公司)。其LNA(locked Nuc leic Acid)鎖核酸,為一種特殊雙環(huán)狀核苷酸衍生物,對RNA有很好地識別能力和強大的親和力,可自由設定Tm值,使所有探針Tm值均一化,保證對所有的靶點具有相同的親和活性。能檢測到常規(guī)DNA探針無法檢測到的極其微量的miRNA。每張芯片對同一樣品重復4次,確保芯片的可靠性。采用miRCURYTMHy3TM/Hy5TMPower labeling kit(Exiqon,Vedbaek,Denmark)標記試劑盒,按照標準操作流程對樣品RNA進行熒光標記。采用miRCURYTmLNA Array雜交試劑盒(v.18.0)(Exiqon)按照標準操作流程,對RNA進行雜交。

1.6 掃描機數(shù)據處理 使用Axon GenePix 4000B microarray scanner對芯片圖形進行掃描。使用Genep ix V6.0讀取原始圖像強度值。芯片中每4個重復探針的實驗結果取平均值。使用中位數(shù)將所有數(shù)據標準化處理。將miRNA中所有掃描信號強度大于30的樣品去背景化矯正后,取這些數(shù)據的50%計算出median值。

1.7 統(tǒng)計學處理 對miRNA進行無人監(jiān)督聚類分析,篩選出差異表達的miRNA。fold changce>1.5或者<0.6(P<0.05)。

2 結 果

2.1 血漿總RNA的質量 本實驗獲得的總DNA樣本,經紫外吸收測定法Nanod rop TM分光記錄儀檢測,所有RNA樣本的OD260/OD280>1.6,為質量合格的標本。

2.2 急性缺血性卒中發(fā)病24 h差異表達miRNA的芯片結果 與健康對照組相比,急性缺血性腦卒中患者在發(fā)病的急性24 h內,共檢測到581個差異表達的miRNA。在581個差異表達miRNA中,425個為差異表達上調fo ldchange>1.5,156個為差異表達下調fo ldchange<0.6。經統(tǒng)計學分析有66個miRNAs的差異表達有統(tǒng)計學意義。66個存在顯著差異表達miRNA,39個為差異表達上調,27個為差異表達下調;差異最顯著的有miR4498上調7.84倍(fo ldchange= 7.8 4),miR 1 8 1 d-3 p上調4.2倍(fo ldchange= 4.72),miR 5196上調4.04倍(fo ldchange=4.04), miR 676-5p下調為0.167(fold change=0.167)。缺血性卒中發(fā)病24 h與正常對照組血漿中存在差異表達的miRNA。

3 討 論

急性腦梗死的病理生理過程復雜,按照病理分期的界定,急性腦梗死在發(fā)病1 h~6 h為超早期,6 h～24 h急性期,24 h~48 h為壞死期,其后為軟化期和恢復期[3]。而在不同的病理時期,腦梗死組織的分子細胞生物水平的變化不同[4],有學者認為缺血性卒中應該按其病理生理分期分型治療。目前,公認對缺血性卒中治療有效的超早期溶栓治療[5],但因地域交通、文化程度、對疾病的認識度等局限,能夠及時接受溶栓治療的患者只有一部分,而且接受了溶栓治療的患者中,也有一部分效果未盡如人意。因此更深的從細胞分子層面探索缺血性卒中發(fā)生的機制,為缺血性卒中早期的治療尋找新理論基礎和治療方向,有實際臨床意義。

微小RNA其強大的調控作用不僅參與了神經系統(tǒng)的發(fā)生[5]、發(fā)育、成熟,也參與調控了神經系統(tǒng)的疾病病理過程[6]。實驗發(fā)現(xiàn),缺血損傷后腦組織和血漿中的一些miRNA表達發(fā)生顯著改變[6,7]。Dha rap[8,9],從缺血再灌注3 h開始持續(xù)到第3天, miRNA的表達一直處于動態(tài)變化中。Yuan[10]發(fā)現(xiàn),全腦缺血模型大鼠,在缺血20 min,再灌注30 min和24 h時血漿和腦組織中miRNA表達水平均出現(xiàn)改變。不同的miRNA在缺血性卒中中發(fā)揮不同的調控作用,如mir126、130a、210、21等可調控促進血管形成[11]。miR124可以下調SCP1的表達,從而誘導胚胎神經發(fā)生,調控軸突生長過程[12]。小鼠動物模型實驗研究顯示miR124與卒中后腦組織損害有特異相關性,miR124在卒中8 h后血漿中濃度升高,在24 h急劇達到高峰[13]。這些研究說明了miRNA參與了急性腦梗死早期的疾病過程,并且調控了血管再生,神經修復等病理過程[14]。局限性腦缺血后因動脈血流灌注減少或血流完全中斷,腦組織缺血缺氧應激,腦組織破壞崩解,出現(xiàn)一系列缺血造成的病理生理變化,稱缺血瀑布。缺血瀑布是一系列級聯(lián)反應,包括細胞因子促進炎癥細胞黏附在血管內皮,破壞血腦屏障,增加腦水腫和細胞毒性酶釋放等[15]。

本研究針對急性缺血性腦卒中發(fā)病的24 h內的血漿miRNA進行表達譜分析。在急性缺血性卒中的24 h內發(fā)現(xiàn)581個有差異表達的miRNA,經統(tǒng)計學分析,有66個有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這些在24 h出現(xiàn)顯著差異變化的miRNA,推斷與缺血性卒中啟動、應激等病理生理機制有關。針對這些在缺血性卒中急性24 h內的miRNA的研究,可以使我們更深的了解“缺血瀑布”這一系列級聯(lián)分子事件最開始狀態(tài)的病理生理機制,并根據其作用的機制做出相應的干預,可以影響缺血性卒中的早期病理過程,或許可以成為缺血性卒中超早期干預治療的潛在靶點。實驗發(fā)現(xiàn)在有統(tǒng)計學意義差異表達的miRNAs中,表達差異最顯著的有miRNA4498、miR181d-3p、miR5196、miR676-5p等,已有相關研究認為抑制miR181可以減少缺血性腦卒中誘發(fā)的神經元凋亡。

本研究豐富了血漿缺血性腦卒中miRNA差異表達譜。針對急性缺血性卒中24 h患者外周血漿中miRNA進行分析,驗證了缺血性卒中的急性期的一系列病理變化受特定的miRNA調控,為尋找缺血性卒中急性期起主要作用的機制和相關miRNA提供了一定的理論基礎。目前已在動物研究使用miRNA抑制劑調節(jié)相關miRNA,影響其下游蛋白的表達,對疾病病理狀態(tài)產生治療作用。本實驗中篩選出來的在24 h出現(xiàn)顯著差異的miRNA4498、miR181d 3p、miR5196、miR676-5p有望成為今后對缺血性卒中急性期干預的新的潛在治療靶點。但對這些miRNA的具體作用靶點及機制還未明確,還需要進行大樣本驗證和進一步的靶基因研究。

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R743 R255

:B

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.07.026

1672-1349(2015)07-0932-03

2015-03-11)

(本文編輯王雅潔)

山西省科技廳科技發(fā)展計劃—社會出版項目(No.2013 313020-9)

1.山西醫(yī)科大學附屬第一臨床醫(yī)學院碩士研究生(太原030009);2.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院;3.山西省太原市中心醫(yī)院;4.山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院

侯玉立,E-mail:ccccxuanxuan@163.com