■張 欣 貝盞臨 丁春霞

(1.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.沾化縣第一中學(xué),山東濱州 256800)

砂引草（Messerschmidia Sibirica Linn.）系紫草科（Boraginaceae）紫丹屬（Tournefortia）植物，又名紫丹草、西伯利亞紫丹。砂引草為多年生宿根中旱生草本，一般4月初萌芽進行營養(yǎng)生長，5～6月開始開花，6～7月結(jié)實，種子8月下旬成熟，果后仍有一段營養(yǎng)期，9～10月逐漸干枯。根狀莖細(xì)長，斜生或匍匐，多水平分布于土表下15～20 cm處，伸展可達1～2 m，垂直根最長可達到1 m左右深處。主要分布于中國大陸及周邊北緯30°～45°相毗鄰的國家，對海拔和環(huán)境周邊要求比較低，海濱砂地、干旱荒漠、山坡道旁均有生長。砂引草屬中旱生植物，在近人棲地和草場植被中的雜草，在我國廣泛分布北方從草原到荒漠、從半濕潤到干旱地區(qū)，可生長于天然的固定、半固定的沙丘上，以及人工固定后的較平緩的沙丘上[1]，目前尚未由人工引種栽培。通常砂引草只是作為食草動物越冬所采食的牧草，據(jù)報道砂引草營養(yǎng)生長期有較高含量的粗脂肪和粗蛋白質(zhì)，其中粗蛋白質(zhì)種類、品質(zhì)還可與紫花苜蓿媲美，有9種人體必需氨基酸的含量高于麥麩和谷類飼料及一般的禾本科牧草，此外砂引草花朵中含有芳香油的分泌細(xì)胞，香味獨特、濃郁悠長。對于砂引草的研究近年來主要集中于其泌鹽結(jié)構(gòu)及對鹽漬沙質(zhì)土壤改良等生態(tài)學(xué)特性的研究[2-3]，而對其多糖成分研究鮮有報道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

砂引草（寧夏）、酒精（AR）、苯酚（AR）、濃硫酸（AR）、純水（15 MΩ.cm）、葡萄糖（標(biāo)準(zhǔn)品）。

1.1.2 實驗器材（見表1）

表1 試驗器材型號及生產(chǎn)廠家

圖1 溫度對提取率的影響

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用UV765紫外-可見分光光度計在390～780 nm范圍內(nèi)進行波譜掃描，檢測最大吸收峰波長為480 nm。以葡萄糖（標(biāo)準(zhǔn)品）測定的線性回歸方程是：C=162.6A-9.717，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9。

1.2.2 多糖含量與提取率的測定

采用苯酚-硫酸法[4]，精密吸取樣品溶液1.0 ml加純水稀釋定容至25.0 ml，從中精密吸取1.0 ml，置于10.0 ml容量瓶中，加純水2.0 ml、5%的苯酚溶液1.0 ml，搖勻，加入濃硫酸5.0 ml，搖勻后置于40℃水浴15 min，冷卻10 min后在波長480 nm處測定吸光度[5]，以純水做空白。多糖提取率計算公式：多糖提取率（%）=[比色液濃度（μg/ml）×比色液體積（ml）×定容體積（250.0 ml）]/[供試樣品體積（0.5 ml）×實驗樣品質(zhì)量（g）×106]×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

溶劑提取法采用水提-醇沉法[6]。選定料液比、浸提溫度、浸提時間3個實驗因素進行試驗。先用90%的乙醇回流1.0 h，然后用蒸餾水提取多糖，選定溫度、時間、料液比3個影響因素，研究糖提取率的影響。

2.1.1 溫度對多糖提取率的影響

稱取等量砂引草5 g，分別置于8個150 ml的圓底燒瓶中，溫度梯度分別為30、40、50、60、70、80、90、100℃，將定容于80 ml的90%乙醇于80℃下回流1 h，提取1次，恒溫水浴分別為30、40、50、60、70、80、90、100 ℃，料液比為1∶20，水浸提時間1.0 h。浸提溫度對砂引草多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著提取溫度的升高，多糖提取率不斷增大，在70℃前增加較為顯著，以后增加不太明顯，溫度在70、80、90℃的提取率曲線較為平緩，同時從提取的多糖溶液可以看出，隨著溫度的升高，多糖顏色加深。超過100℃多糖容易分解產(chǎn)生單糖而溶解在濃乙醇中影響多糖的提取率，因此選擇70～90℃作為提取的較適宜溫度，從曲線中可以看出在70℃時提取率達到了一個頂峰為2.40%。

2.1.2 料液比對多糖提取率的影響

將定容于80 ml的90%乙醇于80℃回流1 h，提取1次，固定水浸提溫度為80℃，料液比分別為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，水浸提時間1 h。結(jié)果見圖2。

圖2 不同料液比對提取率的影響

由圖2可知，隨著加水量的逐漸增大，多糖提取率幾乎呈直線上升。由于提取水量的增加，則提取的多糖溶解在水中的量就越多，從而損失的多糖量就越少，相應(yīng)多糖提取率就高，但增大到一定程度后，多糖提取率幾乎不變，再增加水量多糖的提取率反而降低，因此選擇料液比在1∶30左右提取率較高達到了一個頂峰為2.38%。

2.1.3 浸提時間對多糖提取率的影響

將定容于80 ml的90%乙醇于80℃回流1 h，提取1次。固定水浸提溫度為80℃，料液比1∶20，提取時間分別為1、2、3、4、5 h。結(jié)果見圖3。

圖3 時間對提取率的影響

由圖3可知，隨著加熱時間的增加，多糖提取率在2 h前增加顯著，以后增加較為平緩，增大到一定時間以后多糖提取率幾乎保持不變?？赡苡捎诩訜釙r間過長，促進多糖的溶解使得提取率增大，但是加熱時間過長提取率無明顯變化，考慮到經(jīng)濟效益，提取時間選擇2～3 h為宜，3 h達到提取的達到了一個頂峰為2.44%。

2.1.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化砂引草多糖提取工藝的研究

砂引草→乙醇熱回流→蒸餾水回流→濾液定容于250 ml容量瓶中→濾液定容25 ml容量瓶中稀釋→取出1 ml濾液與10 ml容量瓶中→加入苯酚、濃硫酸、蒸餾水→熱水中加熱15 min冷卻10 min→測OD值。采用Design-Expert軟件完成本實驗的響應(yīng)面分析[7]。在完成單因素實驗后，使用軟件Design-Expert，選擇Response surface中的Box-Benhnken[8]，可以得到溫度時間等高線，溫度料液比等高線和3D曲線圖，由RSM預(yù)測最優(yōu)值，按照要求填入相應(yīng)參數(shù)后預(yù)測最優(yōu)值，得出實驗結(jié)果，選出最優(yōu)提取條件。

2.2 討論

對提取溫度（T）、提取時間（t）、料液比（1∶Z）作如下變換X1=(T-70)/30，X2=(t-3)/2，X3=(Z-30)/10，以3次實驗所得多糖提取率的平均值為響應(yīng)值(Y)，實驗設(shè)計與實驗結(jié)果見表2～表3。其中2、3、6、7、8實驗室用來估計實驗誤差，其他的為析因?qū)嶒?。采用De?sign-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken Design(BBD)設(shè)計見表3，響應(yīng)面分析處理結(jié)果見圖4～圖6。

表2 響應(yīng)面實驗因素水平

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理

圖4 Z=f(X1，X3)的響應(yīng)面與等值線

圖5 Z=f(X1，X2)的響應(yīng)面與等值線

圖6 Z=f(X2，X3)的響應(yīng)面與等值線

通過軟件Design-Expert 8.0.6分析，當(dāng)提取溫度(T)為40 ℃、提取時間(t)為5 h、料液比(1∶Z)為1∶40 mg/ml，砂引草的多糖提取率Y為最大值2.77%。

3 結(jié)論

通過單因素實驗以及3因素3水平的響應(yīng)面法實驗，建立了提取率與各影響因素之間的數(shù)學(xué)模型，依此數(shù)學(xué)模型可以預(yù)測理論提取率，并確定砂引草多糖的最佳提取工藝參數(shù)：浸提溫度40℃、浸提時間5 h、料液比1∶40，在此工藝條件下提取砂引草多糖提取率較高可達2.77%。

響應(yīng)面分析法分析砂引草多糖理論提取最高值為2.77%，依據(jù)此模型提取工藝砂引草實際實驗提取率為2.75%，比理論值提取率要低0.02%。因為在實驗控制不可能達到如此精密，此外提取時間、料液比也會出現(xiàn)人為誤差，為了調(diào)整實驗因素的可操作性和便利性，將時間溫度和料液比修正為整數(shù)，所以出現(xiàn)了理論值的提取率偏差問題。但是提取率偏差不大，可操作性強實用好，能更好的為應(yīng)用到往后的科研實踐中。在單因素的情況下，溫度的最高提取率為2.36%，料液比的最高提取率為2.34%，時間的最高提取率為2.42%。沒有一個單因素的提取率高過理論值，說明響應(yīng)面分析的最優(yōu)值真實可靠。因此，利用響應(yīng)面分析法對砂引草多糖浸提條件的優(yōu)化是可行的，得到的砂引草多糖提取條件真實可靠，具有實用價值。