■翟少偉 賈景濤 孫秀文

（集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門 361021）

近年來(lái)，重金屬污染日趨嚴(yán)重，鎘是水產(chǎn)品安全監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中必測(cè)項(xiàng)目之一。其化合物毒性大，易通過(guò)水環(huán)境及進(jìn)食累積在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)，影響水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)及產(chǎn)品的安全。目前，水環(huán)境鎘對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物毒性的報(bào)道較多，而飼料鎘對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物毒性的研究甚少。飼料鎘作為水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中重金屬威脅的重要來(lái)源之一，應(yīng)該引起足夠的重視，必須警惕其危害[1]，采取有效措施減緩其對(duì)動(dòng)物的毒害影響。使用安全高效驅(qū)除飼料重金屬的添加劑成為人們的研究重點(diǎn)，如蒙脫石、沸石粉、石墨、曲渣、二氧化硅等非金屬礦物質(zhì)對(duì)重金屬有不同程度吸附，以減少動(dòng)物對(duì)重金屬的吸收[2]。這些物質(zhì)一般在飼料中的添加量大、無(wú)特異性吸附，且易對(duì)水體造成二次污染。

目前，殼聚糖（Chitosan，CTS）在污水處理方面有良好效果，對(duì)過(guò)渡金屬元素有特異性吸附，其具有來(lái)源廣、安全、無(wú)毒、耐堿、耐腐蝕、對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)[3-5]。研究表明，低分子量CTS可通過(guò)吸附作用，與養(yǎng)殖水體中的鎘結(jié)合，從而緩解鎘致長(zhǎng)江華溪蟹鰓細(xì)胞的毒害作用[6]；并且CTS可能在很大程度上通過(guò)發(fā)揮吸附作用減輕飼料鎘對(duì)吉富羅非魚(yú)（Genetic improvement of farmed tilapia，GIFT，Oreochromis niloticus）的急性毒性[7]。而在慢性毒性情況下，殼聚糖還能否減輕飼料鎘對(duì)吉富羅非魚(yú)的毒害作用，值得研究。因此，本試驗(yàn)通過(guò)研究飼料鎘脅迫下，添加殼聚糖對(duì)吉富羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能、腸道消化酶活性、血清生化指標(biāo)及鎘殘留水平等方面的影響，評(píng)價(jià)CTS減輕飼料鎘對(duì)吉富羅非魚(yú)毒性的效果，為研發(fā)緩解飼料重金屬對(duì)魚(yú)類毒性的飼料添加劑提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)動(dòng)物為吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)，購(gòu)于廈門誠(chéng)毅水產(chǎn)公司，暫養(yǎng)2周后在集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院生態(tài)實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水系統(tǒng)進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)。從暫養(yǎng)魚(yú)中挑選健康、規(guī)格一致、平均體重為（10.69±0.55）g的240尾吉富羅非魚(yú)幼魚(yú)，分為4個(gè)處理組，即：Cd組、Cd+0.5%CTS組、Cd+1.0%CTS組、Cd+1.5%CTS組，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15尾魚(yú)，試驗(yàn)期為7周。

1.2 試驗(yàn)飼料

羅非魚(yú)基礎(chǔ)飼料參照“羅非魚(yú)配合飼料”標(biāo)準(zhǔn)[8]配制，基礎(chǔ)飼料的配方及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1?；A(chǔ)飼料中鎘本底值為0.21 mg/kg（絕干重）。根據(jù)賈景濤等[9]飼料鎘對(duì)羅非魚(yú)產(chǎn)生亞慢性毒性的研究結(jié)果，向基礎(chǔ)飼料中添加氯化鎘，各處理組飼料鎘元素的水平均為50 mg/kg（實(shí)測(cè)值為55.12 mg/kg）。再分別添加0%、0.5%、1.0%和1.5%的CTS制成試驗(yàn)飼料。各種飼料原料粉碎后過(guò)40目篩后混合均勻，加水?dāng)D壓成直徑2.5 mm的顆粒料，保存于冰箱中備用。CTS為食品級(jí)，購(gòu)于山東奧康生物科技有限公司，分子量約為3×105，脫乙酰度≥90%。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)吉富羅非魚(yú)飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)的水族箱內(nèi)（70 cm×40 cm×40 cm），養(yǎng)殖用水體積約為90 L，水源為充分曝氣除氯后自來(lái)水，日換水量為30%，空氣壓縮機(jī)24 h增氧；試驗(yàn)期間水溫(28±2)℃，pH值為(7.5±0.3)，溶氧濃度7.5～7.8 mg/l，氨氮濃度＜0.2 mg/l。每日飽食投喂三次（8:00、13:00和18:00），投喂30 min后吸取殘餌和糞便。飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，關(guān)閉循環(huán)水系統(tǒng)，繼續(xù)進(jìn)行3周靜水試驗(yàn)。

1.4 樣品采集

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，撈取每個(gè)水族箱中所有試驗(yàn)魚(yú)稱總重，隨機(jī)選擇6尾規(guī)格一致的試驗(yàn)魚(yú)，按照盧俊姣等（2014）的方法采血，制備血清；取肌肉和腸道樣品，并制備組織勻漿上清液。靜水試驗(yàn)過(guò)程中，收集每個(gè)處理組吉富羅非魚(yú)糞便及養(yǎng)殖水體樣品。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算公式如下：

增重率（WGR，%）=100×（Wt-W0）/W0；

特定生長(zhǎng)率（SGR，%/d）=100×(lnWt-lnW0)/t；

飼料系數(shù)（FCR）=FC/(Wt-W0)；

成活率(SR,%)=100×Nf/Ni。

式中：W0——每尾魚(yú)平均初始體重（g）；

Wt——每尾魚(yú)平均終末體重（g）；

FC——平均每尾魚(yú)攝食飼料總量(風(fēng)干樣重，g)；

t——飼喂天數(shù)（d）；

Ni——初始魚(yú)尾數(shù)；

Nf——終末魚(yú)尾數(shù)。

1.5.2 腸道消化酶

脂肪酶和淀粉酶活性采用南京建成生物工程技術(shù)研究所提供的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。蛋白酶活性的測(cè)定采用福林-酚試劑法，以磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH值，680 nm處測(cè)吸光值。

1.5.3 血清生化指標(biāo)

采用南京建成生物工程技術(shù)研究所提供的試劑盒及方法，測(cè)定血液中白蛋白（Albnmin，ALB）、尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamicpyruvic transaminase，GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamicoxalacetic transaminease，GOT）等生化指標(biāo)。

1.5.4 鎘水平

吉富羅非魚(yú)飼料中鎘水平和糞便中鎘水平測(cè)定參照“飼料中鎘的測(cè)定方法”[10]；組織中鎘的測(cè)定參照“國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第6部分：生物體分析”[11]進(jìn)行。養(yǎng)殖水體不需前處理，離心后可直接通過(guò)火焰原子吸收光譜法測(cè)定鎘水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±S.D.)”表示，用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若存在顯著差異，則采用Duncan's法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖對(duì)飼料鎘脅迫下吉富羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表2）

由表2可見(jiàn)，Cd+CTS各處理組的WGR和SGR顯著高于Cd組（P＜0.05），且隨著CTS添加水平的增加逐漸升高；而FCR和SR各處理組間的差異不顯著（P＞0.05）。Cd+CTS各處理組間WGR差異不顯著（P＞0.05）；Cd+1.5%CTS組的 SGR 顯著高于Cd+0.5%CTS組（P＜0.05），Cd+1.0%CTS組與 Cd+0.5%CTS組、Cd+1.5%CTS組間的差異不顯著（P＞0.05）。

表2 CTS對(duì)飼料鎘脅迫條件下吉富羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

2.2 殼聚糖對(duì)飼料鎘脅迫下吉富羅非魚(yú)腸道消化酶活性的影響(見(jiàn)表3)

表3 CTS對(duì)飼料鎘脅迫條件下吉富羅非魚(yú)腸道消化酶活性的影響(U/mg prot.)

由表3可以看出，腸道消化酶的活性數(shù)值上隨著CTS添加水平的增加而升高，僅Cd+1.5%CTS組淀粉酶活性顯著高于Cd組(P＜0.05)，其他各處理組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)；Cd+1.0%CTS組和Cd+1.5%CTS組的脂肪酶活性顯著高于Cd組(P＜0.05)，各Cd+CTS組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)；Cd+CTS處理組的蛋白酶活性顯著高于Cd組(P＜0.05)，但三個(gè)Cd+CTS處理組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.3 殼聚糖對(duì)飼料鎘脅迫下吉富羅非魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響(見(jiàn)表4)

表4 CTS對(duì)飼料鎘脅迫下吉富羅非魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

由表4可見(jiàn)，隨CTS添加水平的增加，吉富羅非魚(yú)血清ALB逐漸升高，但各處理組間均無(wú)顯著差異（P＞0.05）；BUN、GPT和GOT隨CTS添加水平升高而逐漸降低，Cd+1.0%CTS組和Cd+1.5%CTS組的BUN水平和GPT活性顯著低于Cd組（P＜0.05），各 Cd+CTS組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；Cd+CTS組GOT活性顯著低于Cd組（P＜0.05），Cd+1.0%CTS組和Cd+1.5%CTS組GOT活性顯著低于Cd+0.5%CTS組（P＜0.05），Cd+1.0%CTS組和Cd+1.5%CTS組間差異不顯著。

2.4 殼聚糖對(duì)飼料鎘脅迫下吉富羅非魚(yú)腸道、肌肉、糞便和養(yǎng)殖水體中鎘殘留水平的影響(見(jiàn)表5)

表5 CTS對(duì)飼料鎘脅迫下吉富羅非魚(yú)腸道、肌肉、糞便和養(yǎng)殖水體中鎘水平的影響

由表5可見(jiàn)，隨著CTS添加水平而增加，Cd+CTS各處理組（除Cd+0.5%CTS組外）鎘日攝入量均顯著高于Cd組（P＜0.05），Cd+CTS各處理組的腸道、肌肉和養(yǎng)殖水體中鎘的殘留水平呈明顯下降趨勢(shì)，且顯著低于Cd組（P＜0.05），而糞便中鎘水平呈明顯上升趨勢(shì)，且顯著高于Cd組（P＜0.05）。Cd+CTS各處理組的腸道和肌肉鎘殘留水平，除Cd+1.5%CTS組顯著低于Cd+0.5%CTS組外（P＜0.05），其他Cd+CTS處理組間差異不顯著（P＞0.05）；而Cd+CTS各處理組間的糞便和養(yǎng)殖水體鎘水平間存在顯著差異（P＜0.05）。

3 討論

羅非魚(yú)體內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性很弱，對(duì)CTS的分解十分有限，大部分CTS隨糞便排出體外[12]；CTS在中性偏堿性環(huán)境中對(duì)鎘具有較強(qiáng)的吸附能力[5,13]，這與吉富羅非魚(yú)腸道內(nèi)pH值7.2～8.3范圍比較接近[14]，并且殼聚糖還可延長(zhǎng)飼料在動(dòng)物腸道中停留的時(shí)間[15]。因此，殼聚糖在吉富羅非魚(yú)腸道內(nèi)存在發(fā)生吸附作用的理論基礎(chǔ)。從本試驗(yàn)結(jié)果看，從不同組織、糞便及養(yǎng)殖水體中鎘水平的變化情況來(lái)看，隨著CTS添加水平的增加，與Cd組相比，Cd+CTS處理組鎘日攝入量分別增加8.27%、52.53%和53.53%；腸道鎘殘留水平分別降低54.7%、67.3%和75.2%；肌肉鎘殘留水平分別降低46.2%、63.2%和89.6%；糞便中鎘殘留水平分別升高45.8%、116.3%和152.2%；而養(yǎng)殖水體中鎘殘留分別降低27.4%、37.8%和52.4%。值得注意的是，糞便中鎘水平增加的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于鎘日攝入量增加的幅度，且養(yǎng)殖水體中的鎘水平未隨著排除糞便中鎘水平的增加而升高，這說(shuō)明殼聚糖在吉富羅非魚(yú)腸道內(nèi)發(fā)生了吸附作用。研究表明，殼聚糖分子鏈中存在大量帶孤對(duì)電子的活性基團(tuán)(主要是-NH2、-OH)，這些基團(tuán)上的孤對(duì)電子可投入到重金屬離子的空軌道中，通過(guò)配位鍵與重金屬離子結(jié)合，從而形成穩(wěn)定螯合聚合物[16]。王志華等[17]認(rèn)為，-NH2是殼聚糖吸附鎘的活性基團(tuán)，-OH不參與吸附反應(yīng)，在吸附過(guò)程中2個(gè)氨基與1個(gè)鎘離子可通過(guò)電價(jià)配鍵形成穩(wěn)定的電價(jià)絡(luò)合物。

研究表明，羅非魚(yú)消化酶活性、血清生化指標(biāo)等方面的毒性隨飼料鎘水平增加而增加，生長(zhǎng)受到抑制[9，18]。本試驗(yàn)中，在飼料鎘脅迫下添加CTS后，腸道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性都有不同程度的提高，其中蛋白酶的活性在各CTS添加水平下都得到了顯著改善；血液生化指標(biāo)中GPT和GOT水平的降低代表肝臟功能的改善，BUN水平的降低表明了蛋白質(zhì)利用程度的提高，ALB水平未顯著改變，也顯示了免疫功能也得到了一定程度的改善。上述生理指標(biāo)的改善很可能與CTS在腸道內(nèi)吸附飼料鎘減少體內(nèi)蓄積和增加排出體外有關(guān)。目前，通過(guò)減少飼料鎘在魚(yú)體腸道的吸收或增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力來(lái)緩解其毒害作用是主要的營(yíng)養(yǎng)策略[18-20]。已有利用硅酸鹽納米級(jí)微球LSN分別吸附飼料鎘[18]、飼料鉛[19]的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)飼料中添加LSN可減少魚(yú)體組織重金屬的殘留量，提高消化酶活性，增強(qiáng)抗氧化能力，改善血清生化指標(biāo)。研究表明，在虹鱒飼料中添加3%CTS可有效降低肝臟中鎘殘留水平[21]。Zhai等[20]通過(guò)在飼料鉛脅迫下的羅非魚(yú)飼料中添加800 mg/kg槲皮素，提高機(jī)體抗氧化水平而顯著改善飼料鉛對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用。

進(jìn)入魚(yú)體的CTS一部分與鎘結(jié)合排出體外，其他部分可被降解為低聚糖，并發(fā)揮其它生物學(xué)活性來(lái)提高魚(yú)腸道消化酶活性[22-23]、改善血清生化指標(biāo)[24-26]、提高肝胰臟抗氧化能力[27]，從而達(dá)到促生長(zhǎng)的效果。研究表明，飼料中添加CTS可提高異育銀鯽[22]、花鱸[28]、軍曹魚(yú)[29]、草魚(yú)[30]、鯉魚(yú)[23,31]、虹鱒[32]、吉富羅非魚(yú)[33]等的生長(zhǎng)性能。

綜上所述，在飼料鎘慢性脅迫下，CTS能夠提高吉富羅非魚(yú)生長(zhǎng)性能、腸道消化酶活性、改善血液生化指標(biāo)，這是CTS發(fā)揮生物學(xué)活性和吸附作用的共同結(jié)果。但從各處理組腸道、肌肉、糞便和養(yǎng)殖水體中鎘殘留水平的變化，以及CTS對(duì)飼料鎘致吉富羅非魚(yú)急性毒性的減輕程度來(lái)看，我們認(rèn)為CTS在腸道吸附飼料鎘起主要作用。關(guān)于CTS吸附特性和其生物學(xué)活性這兩方面分別在減輕飼料鎘毒性過(guò)程中發(fā)揮作用的具體情況，還有待于深入研究。

4 小結(jié)

在50 mg/kg飼料鎘脅迫下，飼料中添加CTS可減輕飼料鎘對(duì)吉富羅非魚(yú)的生長(zhǎng)、部分腸道消化酶活性和血清生化指標(biāo)等方面的抑制作用；隨CTS添加水平的升高，糞便中鎘的排出量增加，腸道、肌肉和養(yǎng)殖水體中鎘水平顯著降低。