■趙 笛 周彥品 榮芷銘 杜 維 趙長新

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034）

海參養(yǎng)殖是大連地區(qū)的一大特色產(chǎn)業(yè)，海參養(yǎng)殖方式多種多樣,隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，其對飼料的要求越來越高，海參飼料研究越來越受到業(yè)內(nèi)人士的關(guān)注[1]。然而，目前海參養(yǎng)殖存在餌料單一、營養(yǎng)不足、海參體質(zhì)下降等問題[2]，若過度投喂人工飼料又會帶來水質(zhì)惡化、海參生長環(huán)境遭到破壞的負(fù)面影響。而海洋紅酵母具有繁殖速度快、色素積累快的特點(diǎn)，同時(shí)，菌體內(nèi)由番茄紅素為前體物質(zhì)合成的蝦青素具有提高幼苗的增重率和存活率的效果，是海參養(yǎng)殖中最佳的天然餌料[3]。近年來，國內(nèi)已開始工業(yè)化試生產(chǎn)海洋紅酵母飼料，并將其用于飼料添加劑中[4-6]。薛德林等[7]指出，在養(yǎng)殖水體中添加海洋紅酵母能抑制弧菌增殖，降低海參的發(fā)病率，提高海參幼體的變態(tài)率和成活率，從而提高海參的產(chǎn)量。王歲樓[8]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，在一定程度上提高了菌體濃度，但是其蝦青素含量沒有得到提高，而且培養(yǎng)成本并未降低。鑒于此研究現(xiàn)狀，本試驗(yàn)從大連渤海海域篩選出一種高產(chǎn)蝦青素海洋紅酵母，對其進(jìn)行菌種純化及鑒定，并優(yōu)化其培養(yǎng)條件，旨在提高海洋紅酵母菌的產(chǎn)量及質(zhì)量，并希望借此推動(dòng)遼寧省海參養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 菌種

酵母菌從大連渤海灣提取得到。

1.2 材料與儀器

1.2.1 材料

番茄紅素（食品級），大麥（中糧麥芽大連有限公司），磷酸、葡萄糖、酵母粉、KH2PO4（均為分析純）。

1.2.2 儀器

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(上海三中醫(yī)療器械有限公司)；高速冷凍離心機(jī)（賽默飛）；WFEUV—2000型紫外可見分光光度計(jì)[龍尼柯（上海）儀器有限公司]；E221型生物顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；HQ45恒溫?fù)u床，DYY-Ⅲ33B 型電泳槽，DY-W2型電泳儀，MJRe-search-PTC-200PCR儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基

采用2Brix的麥汁培養(yǎng)基。

1.3.2 富集培養(yǎng)

培養(yǎng)方法參考杜連祥等（2010）[9]的方法。

1.3.3 菌種26SrDNA鑒定

1.3.3.1 變性

在斜面培養(yǎng)基中挑取菌體于50μl TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中變性后離心取上清作為模板。反應(yīng)條件為：80 ℃、15 min。

1.3.3.2 PCR擴(kuò)增

使用TaKaRa Fungi Identification PCR Kit(Code No.9164)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增條件見表1。

表1 擴(kuò)增條件

1.3.3.3 測序

將PCR產(chǎn)物經(jīng)脫鹽純化后，由寶生物（大連）科技發(fā)展有限公司進(jìn)行測序。

1.3.4 菌數(shù)計(jì)數(shù)

采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法[6]。

1.3.5 海洋紅酵母中蝦青素含量的測定

采用楊文（1995）[10]的測定方法。

1.3.6 蝦青素含量的計(jì)算

蝦青素含量（μg/g干菌體）=A×D×V/0.16W。

式中：A——吸光度；

D——稀釋倍數(shù)；

V——丙酮體積（ml）；

W——細(xì)胞質(zhì)量（g）；

0.16——胡蘿卜素摩爾消光系數(shù)。

1.3.7 海洋紅酵母菌常規(guī)培養(yǎng)

培養(yǎng)基：葡萄糖0.8%、酵母粉0.5%、KH2PO40.05%。培養(yǎng)條件為150 r/min，初始pH值為6，溫度為28℃，接種量10%進(jìn)行搖床培養(yǎng)，在72 h后進(jìn)行菌濃度和蝦青素含量測定。

1.3.8 菌體制備過程中工藝參數(shù)優(yōu)化

①分別在不同溫度、接種量、搖瓶轉(zhuǎn)速和初始pH值的條件下進(jìn)行海洋紅酵母的發(fā)酵培養(yǎng)，在培養(yǎng)72 h后，進(jìn)行酵母菌數(shù)和蝦青素含量的測定。

②經(jīng)前期培養(yǎng)條件優(yōu)化后，在不同時(shí)間向培養(yǎng)基中投放不同量的蝦青素的前體物質(zhì)番茄紅素，并且搖瓶發(fā)酵72 h后，進(jìn)行酵母菌數(shù)和蝦青素含量的測定。

1.3.9 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基初始pH值對海洋紅酵母菌濃度和蝦青素含量具有極大的影響，所以對初始pH值、番茄紅素的添加量及添加時(shí)間以蝦青素含量和菌濃度作為評定標(biāo)準(zhǔn)，采用響應(yīng)面分析法對海洋紅酵母的培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 26SrDNA菌種鑒定結(jié)果

2.1.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，在第一泳道可見預(yù)期大小片段，將該片段進(jìn)行凝膠回收，送測序。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.1.2 測序結(jié)果

測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行比對，確定該株海洋紅酵母為Rhodosporidium diobovatum。

2.2 菌體培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化(見圖2)

圖2 溫度對菌種發(fā)酵的影響

由圖2可知，培養(yǎng)溫度對菌濃度和蝦青素含量的積累均有影響。菌濃度和蝦青素含量先隨溫度升高而增加；當(dāng)溫度超過30℃后，隨溫度升高而降低。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，菌濃度和蝦青素含量均達(dá)到最大值，分別為9.38×108CFU/ml和798μg/g。因此，可以確定其最佳發(fā)酵溫度為30℃，接下來試驗(yàn)均在30℃條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

2.2.2 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的優(yōu)化(見圖3)

由圖3可知，轉(zhuǎn)速為120～180 r/min時(shí)菌數(shù)和蝦青素含量均不斷的提升，當(dāng)轉(zhuǎn)速超過180 r/min的時(shí)候，蝦青素含量和菌濃度均呈下降趨勢，轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)菌數(shù)達(dá)到最大值為9.56×108CFU/ml，蝦青素的含量也達(dá)到最大值，為886μg/g。因此，可以確定其最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為180 r/min，后續(xù)試驗(yàn)均在180 r/min條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

圖3 轉(zhuǎn)速對菌種發(fā)酵的影響

2.2.3 接種量的優(yōu)化（見圖4）

圖4 接種量對菌種發(fā)酵的影響

結(jié)果表明，接種量從6%增加到10%時(shí)，菌數(shù)從7.98×108CFU/ml增加到 10.34×108CFU/ml，提高了29.6%。當(dāng)接種量為10%時(shí)，其菌數(shù)表現(xiàn)出最高水平，為10.43×108CFU/ml。而當(dāng)接種量超過10%時(shí)，其菌數(shù)表現(xiàn)出下降趨勢，當(dāng)接種量增加到14%時(shí)，其菌數(shù)降到8.64×108CFU/ml，較10%的條件時(shí)下降17.2%。并且當(dāng)接種量為10%的時(shí)候，其蝦青素的含量也達(dá)到最高值，為932μg/g，因此，進(jìn)一步試驗(yàn)選擇接種量為10%。

2.2.4 初始pH值的優(yōu)化

選用磷酸緩沖液對培養(yǎng)基進(jìn)行初始pH值的校定，不同初始pH值下菌濃度和蝦青素含量測定結(jié)果如圖5所示。開始，菌濃度和蝦青素含量隨著pH值的升高而逐漸上升，當(dāng)pH值高于5.0時(shí)，隨著pH值的上升，菌濃度和蝦青素含量反而下降。pH值5.0時(shí)，菌數(shù)最高，為11.66×108CFU/ml，蝦青素含量也達(dá)到最高值，為1 053μg/g，因此，進(jìn)一步試驗(yàn)選擇pH值為5.0。

圖5 初始pH值對菌種發(fā)酵的影響

2.2.5 添加番茄紅素時(shí)間的優(yōu)化（見圖6）

圖6 不同添加時(shí)間對菌種發(fā)酵的影響

在24 h前投放番茄紅素時(shí)其菌濃度和蝦青素含量均穩(wěn)步上升，在24 h后投放番茄紅素，菌濃度基本趨于平衡而蝦青素含量呈下降趨勢。在菌體發(fā)酵24 h時(shí)添加番茄紅素，其蝦青素的含量最高，達(dá)到1 412μg/g，菌濃度也達(dá)到最大值，為14.03×108CFU/ml，所以進(jìn)一步試驗(yàn)選擇在菌體發(fā)酵24 h時(shí)投放番茄紅素。

2.2.6 番茄紅素添加量的優(yōu)化（見圖7）

圖7 不同添加量對菌種發(fā)酵的影響

由圖7結(jié)果可知，番茄紅素的添加量對菌數(shù)和蝦青素含量的積累均具有很大影響。開始隨著番茄紅素投放量的增大其菌濃度和蝦青素含量均上升，當(dāng)投放量超過60μg時(shí)菌濃度和蝦青素含量均呈下降趨勢。當(dāng)投放蝦青素的量為60μg時(shí)，蝦青素含量達(dá)到最大，為1 586μg/g，菌濃度也達(dá)到最大值，為15.38×108CFU/ml。所以確定番茄紅素投放量為60μg。

2.2.7 響應(yīng)面分析[11]

通過上述單因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵的初始pH值、投放番茄紅素的時(shí)間和質(zhì)量對海洋紅酵母的生長及蝦青素含量的積累具有很大的影響，所以針對這三個(gè)試驗(yàn)因素，利用Design Expert 8.0軟件，采用中心組合試驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)曲面工藝優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表2。試驗(yàn)共設(shè)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，包括12個(gè)析因點(diǎn)和5個(gè)中心點(diǎn)，結(jié)果如表3所示。其中Y1為蝦青素含量（μg/g），Y2為菌濃度（×108CFU/ml），A為添加量（μg），B為添加時(shí)間（h），C為初始pH值。

表2 Box-Behnken因素水平編碼設(shè)計(jì)

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.8 海洋紅酵母菌發(fā)酵過程中蝦青素含量的響應(yīng)面回歸模型方差分析（見表4）

由表4可知，模型的F值為53.36，其中P值＜0.01，表明模型是顯著的。在此模型中B、A2、B2、C2為顯著項(xiàng)?？傮w上講，模型的擬合程度很好、試驗(yàn)誤差較小，模型成立，可以用此模型對海洋紅酵母發(fā)酵條件進(jìn)行分析。對表4中的結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，可得海洋紅酵母發(fā)酵過程中蝦青素含量的二次回歸方程為：Y1=1 561.6+15.50×A+68.5×B+10.50×C-8.00×AB+4.5×AC-11×BC-73.05×A2-229.55×B2-43.55×C2。

海洋紅酵母發(fā)酵過程中各因素兩兩交互作用對蝦青素含量的影響如圖8所示。由圖8可知，番茄紅素添加時(shí)間和添加量的交互作用對蝦青素積累影響最為明顯，而發(fā)酵的初始pH值和添加量的交互作用對蝦青素積累影響最小。

表4 海洋紅酵母發(fā)酵過程中蝦青素含量響應(yīng)面回歸模型方差分析

圖8 添加量(A)、添加時(shí)間(B)、初始pH值(C)交互作用對蝦青素含量的影響

2.2.9 海洋紅酵母菌發(fā)酵過程中細(xì)胞數(shù)量的響應(yīng)面回歸模型方差分析（見表5）

表5 海洋紅酵母發(fā)酵過程中菌濃度響應(yīng)面回歸模型方差分析

由表5可知，模型的F值為46.26，其中P值＜0.01，表明模型是顯著的。在此模型中B、A2、B2為顯著項(xiàng)。總體上講，模型的擬合程度很好、試驗(yàn)誤差較小模型成立，可以用此模型對海洋紅酵母發(fā)酵條件進(jìn)行分析。

對表5中的結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，可得海洋紅酵母發(fā)酵過程中菌濃度的二次回歸方程為：Y2=14.80+0.11×A+0.66×B-0.088×C-0.11×AB-0.023×AC-0.34×BC-0.73×A2-2.65×B2-0.31×C2。

海洋紅酵母發(fā)酵過程中各因素兩兩交互作用對菌濃度的影響如圖9所示。由圖9可看出，番茄紅素的添加時(shí)間和添加量的交互作用對此菌株的菌量積累影響最為明顯，而發(fā)酵初始pH值和添加量的交互作用對菌濃度的影響最不明顯。

采用Design Expert8.0.6軟件進(jìn)行發(fā)酵條件的篩選，得到最佳發(fā)酵工藝參數(shù)：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值為4.99，添加番茄紅素的量為62μg，在菌種發(fā)酵了27.25 h投放番茄紅素，其理論蝦青素含量和酵母細(xì)胞數(shù)最大分別為1 567.12μg/g和14.85×108CFU/ml。所得工藝條件需要進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖9 添加量(A)、添加時(shí)間(B)、初始pH值(C)交互作用對酵母細(xì)胞數(shù)的影響

2.3 發(fā)酵工藝條件的驗(yàn)證

對響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，得到的最優(yōu)條件。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，并且與1.3.7培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，結(jié)果如表6所示。

在上述發(fā)酵條件下，發(fā)酵液的菌濃度和蝦青素含量與預(yù)測值之間無顯著差異，并且明顯高于優(yōu)化前海洋紅酵母發(fā)酵的濃度和蝦青素含量，說明模型有效，使用該模型優(yōu)化出的試驗(yàn)結(jié)果可信度高，具有實(shí)用價(jià)值。并且此優(yōu)化方法更為優(yōu)越。

3 結(jié)論

海洋紅酵母作為海參餌料越來越受到人們關(guān)注。研究表明，海洋紅酵母對海參養(yǎng)殖起到積極作用，不僅可以提高海參的存活率，并且對海參營養(yǎng)價(jià)值也起到積極的作用。海洋紅酵母作為海參餌料需要具備菌濃度和蝦青素含量高的特點(diǎn)。朱曉立等[12]研究發(fā)現(xiàn)，前體物質(zhì)的添加能夠提高蝦青素含量，這與本文的結(jié)論基本一致。本文通過26SrDNA的鑒定，確定該株從渤海灣提取的酵母菌Rhodosporidium diobovatum，單因素試驗(yàn)和Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理以及響應(yīng)面分析對海洋紅酵母的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，擬合了初始pH值、添加番茄紅素的質(zhì)量和添加時(shí)間這3個(gè)因素對海洋紅酵母菌濃度和蝦青素含量的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型合理可靠，由該模型確定的最佳工藝條件為:培養(yǎng)基初始pH值為4.99，在菌種發(fā)酵了27.25 h時(shí)添加62μg的番茄紅素，并且結(jié)合單因素試驗(yàn)發(fā)酵溫度30℃，控制搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min，接種量為10%。在此條件下，得到的最優(yōu)酵母細(xì)胞數(shù)為14.82×108CFU/ml和蝦青素含量為1 571.00μg/g，此培養(yǎng)方式與常規(guī)培養(yǎng)方式相比分別提高了64.12%和86.14%。

表6 響應(yīng)面優(yōu)化驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果