曹凱淇

·綜述·

蛋白質組學在糖尿病中的應用

曹凱淇

糖尿病是人類慢性病之一，是目前世界范圍內繼腫瘤、心血管疾病后的第三位嚴重危害人類健康的非傳染性疾病。糖尿病長期的代謝紊亂常常引起多個系統(tǒng)的損傷，可導致心、眼、腎、神經和血管等器官組織的慢性進行性改變或者功能減退及衰竭。及時、早期診斷治療糖尿病可以有效地控制血糖水平及防止并發(fā)癥的發(fā)生。隨著人類基因組計劃的完成，分子生物的研究領域已轉移到蛋白質組學的研究。蛋白質組學是全球評價蛋白表達的有力工具，尚未廣泛地用于糖尿病的研究。本文對照糖尿病和正常組織間的蛋白質表達譜，發(fā)現(xiàn)有利于糖尿病及其并發(fā)癥的新的研究靶點，對糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病機制的蛋白質組學研究技術進行了概括介紹。

糖尿病；蛋白質組學；應用

1 前言

糖尿病是嚴重危害人類健康的疾病之一，WTO認為到2025年世界上約有3.3億糖尿病患者。目前我國已取代印度，成為全球糖尿病第一大國，并且仍以每年超過120萬人的速度增加，已成為糖尿病發(fā)病的“重災區(qū)”?；颊咧饕?型糖尿病為主，占90%～95%[1]。雖然對糖尿病的發(fā)病機制已經做了很大的努力，但糖尿病及其并發(fā)癥背后的發(fā)病機制仍未明確。自從研究者們通過識別和量化糖尿病患者及對照組的組織、細胞或細胞器中蛋白質的差異表達，蛋白質組學越來越受到歡迎?，F(xiàn)今，蛋白質組學的飛速發(fā)展為糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)現(xiàn)提供了有力的條件，可以有效的篩選和發(fā)現(xiàn)生物標志物，對糖尿病及其并發(fā)癥的鑒定和治療學的新方向發(fā)揮了有效的作用。本文概述了近年來對糖尿病及其并發(fā)癥的蛋白質組學研究，應用各種蛋白質組學技術方法，找到糖尿病相關蛋白質標志物。

2 蛋白質組學技術的發(fā)展

蛋白質組(proteome)一詞，來源于蛋白質(protein)與基因組(genome)兩個詞的雜合。這一概念是由澳大利亞學者Wilkins和Willions等人于1994年提出，是指一種細胞、組織或有機體所表達的全部蛋白質。蛋白質組學是以蛋白質組為研究對象，對組織、細胞的整體蛋白進行檢測。包括蛋白質表達水平、氨基酸序列、翻譯后加工和蛋白質間的相互作用，在蛋白質水平上了解細胞的各項功能、各種生理、生化過程及疾病的生理過程等?？梢?，蛋白質組學就是以細胞或組織不同時間、環(huán)境的所有蛋白質為研究對象，從整體上研究蛋白質的種類、相互作用以及功能結構的學問。

蛋白質組學大致可以分為基于膠的差異分析技術及非膠差異分析技術，前者主要包括雙向凝膠電泳、熒光雙向差異凝膠電泳等，后者包括多維液相色譜、穩(wěn)定同位素特征標簽生物質譜、蛋白質芯片技術和表面增強激光解析電離分析時間質譜技術等[2]。

3 蛋白質組學技術對糖尿病的應用

隨著我國人口老齡化的加劇和人們生活方式的改變，2型糖尿病的患病率不斷升高，因其他疾病必須接受手術治療的糖尿病患者也日漸增多。

Cabre等[3]在研究糖尿病患者中Apo多形態(tài)與高血脂的關聯(lián)中發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者中TC雜合子血漿Apo A5水平及富含TG的脂蛋白濃度是TT純合子的兩倍，提示2型糖尿病患者Apo A5-1131T＞C基因型多態(tài)性影響Apo A5的功能。

研究表明胰腺癌也許會導致糖尿病的發(fā)生。Wang等[4]旨在識別這些有可能與胰腺癌誘導糖尿病的相關蛋白質。他們利用相對和絕對定量(i-TRAQ)加上二維液體色譜，用質譜法比較胰腺癌患者組織中與糖尿病相關或無關的蛋白質表達，及相鄰非腫瘤組織中有無糖尿病相關的蛋白。S100鈣結合蛋白129和乙醛脫氫酶2家族被選擇用來驗證蛋白質免疫印跡和免疫組化結果。對胰腺癌相關蛋白質的識別，以便更好理解和進一步探索胰腺癌相關蛋白質的病因和病機。

Kim[5]團隊專注于2型糖尿病的胰島素抵抗的肝臟、肌肉和脂肪組織的結果。他們使用蛋白質組學和生物信息學的方法，以確定新的肝細胞相關的膜蛋白、肝臟胰島素抵抗、脂肪肝及2型糖尿病的發(fā)展。使用FT-ICR-MS技術，確定了在正常和2型糖尿病db/db小鼠肝臟中95種顯著差異表達的蛋白質，這些蛋白主要參與能量代謝途徑，分子運輸和蜂窩信號，而這些中的大多數(shù)以前并沒有用于糖尿病的研究中。生物信息學分析顯示，16個蛋白質可能與肝臟中胰島素信號的調節(jié)有關。他們也許可以作為有效的診斷標志物和(或)治療方法。

Zhang等[6]使用全球液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)蛋白分析技術，確定了24種血清蛋白在1型糖尿病患者和健康對照組之間存在著差異。從功能上，這些蛋白質代表先天免疫反應，激活補體級聯(lián)，炎癥反應和凝血等。16肽具有很好的鑒別力，血小板堿性蛋白肽和C1抑制劑具有100%敏感性和100%特異性。這些生物標志物可以將1型糖尿病與健康對照組和2型糖尿病區(qū)分開。充分顯示了先天免疫反應與1型糖尿病的發(fā)展存在某種關聯(lián)。

1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，其特征是在胰島β細胞中存在自身抗體。然而，高達2%～5%患有1型糖尿病患者中已知抗體陰性，這表明1型糖尿病患者中自身抗原面板并不完整。為了確定新的1型糖尿病自身抗原，Massa O等[7]采用熒光免疫和2-DE技術對臨床診斷為1型糖尿病且自身抗體陰性的受試者血清進行鑒別，其中有111種蛋白質質譜被識別。在目前的工作中，他們精心選擇了少數(shù)自身免疫抗體和基因均陰性的患者，在胰島β細胞提取以確定新的候選1型糖尿病自身抗體。

為了在尿液中發(fā)現(xiàn)獨特的分子特征，證明其與1型糖尿病的發(fā)展過程有關，Soggiu A等[8]對1型糖尿病患者和正常對照組微量白蛋白進行對比分析，利用高分辨率二維凝膠電泳分離和MALDI-TOF-MS、LC-MS蛋白質分離技術，對1型糖尿病患者和對照組尿液進行研究。結果發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病患者和對照組間幾種蛋白質存在表達差異，特別是5種蛋白下調和4種蛋白上調。低表達的蛋白分別為Tamm-Horsfall尿糖蛋白、載脂蛋白A、載脂蛋白E、α2-巰基蛋白酶抑制劑、人類補體調節(jié)蛋白CD59；同時較高表達的有α1微球蛋白、鋅α2糖蛋白、α1β糖蛋白、視黃醇結合蛋白等4種。這些差異始終存在于1型糖尿病患者與健康對照組中。此外，這些蛋白還與糖化血紅蛋白有關。這項研究提供了新的見解：尿蛋白可作為1型糖尿病蛋白質分子機制的潛在的預后標志物。

4 蛋白質組學在糖尿病并發(fā)癥中的應用

糖尿病可影響心臟、血管、腎、眼等多系統(tǒng)組織，伴隨或引發(fā)多種急性或慢性并發(fā)癥，損害健康甚至危害到生命。如：DKA、糖尿病非酮癥性高滲綜合征、乳酸性酸中毒等急性并發(fā)癥，以及足病、腎病(腎衰竭、尿毒癥)、眼病、腦病、心臟病、皮膚病等慢性并發(fā)癥。英國前瞻性糖尿病研究表明，新診斷的2型糖尿病中約一半已有血管并發(fā)癥[9]。

蛋白質組學方法能夠更好地了解糖尿病并發(fā)癥的病理生理。鑒于此，Bhonsle HS等[10]在糖尿病患者血漿樣本的差異蛋白表達蛋白質組學和免疫印跡分析相結合的研究，雙向凝膠電泳和液相色譜-質譜聯(lián)用顯示差異表達的蛋白質，包括纖維蛋白原，結合珠蛋白的上調和下調的維生素D結合蛋白、α1抗胰蛋白酶、甲狀腺素運載蛋白和載脂蛋白A，在糖尿病和健康對照組患者血清中表達有差異。在這些蛋白中，Apo A1下調在糖尿病控制不佳組中表現(xiàn)尤為突出。因此，Apo A1的下調可作為糖尿病并發(fā)癥早期預測指標。

4.1 糖尿病腎臟疾病 糖尿病腎臟疾病(DKD)是糖尿病最常見、最嚴重的微血管慢性并發(fā)癥，發(fā)病率逐年增高，已成為危害人類健康的重大疾病。在歐美國家，糖尿病腎病也是終末期腎病(End-stage renal disease，ESRD)的最常見病因，約占全部ESRD病例的44%。DKD起病隱匿，臨床上早期診斷糖尿病腎臟疾病存在較大困難。腎穿刺活檢術創(chuàng)傷大，并發(fā)癥多，且費用較高，患者難以承受，而尿液中富含腎臟病變信息，取材簡單，無創(chuàng)傷。姜洪娟[11]利用雙向凝膠電泳和熒光差異凝膠電泳技術對2型糖尿病尿液標本進行比較蛋白質組學分析。篩選糖尿病腎臟疾病患者尿液中的差異表達蛋白，通過2-DE和2D-DIGE/MS兩種蛋白質組學方法，均被鑒定出來的6種蛋白分別是：上皮細胞鈣粘蛋白、血清白蛋白、鋅α2糖蛋白、α1酸性糖蛋白、視黃醇結合蛋白、尿調節(jié)素。這些差異蛋白的識別為糖尿病腎病的早期診斷研究提供了候選標志物，有助于DKD早期診斷和發(fā)病機制的深入探索。

Zurbig等[12]認為尿蛋白組分析技術可以作為預測糖尿病腎病的一種工具，毛細血管電泳耦合質譜用于分析尿中低分子量蛋白質組。收集1型和2型糖尿病患者尿液標本，這些標本事前用產生慢性腎臟疾病的生物標志物進行分類，進行長達5年的尿白蛋白追蹤檢測。對每個尿慢性腎臟疾病生物標志物進行了統(tǒng)計分析，并描述它對于將來診斷糖尿病腎病的可能性。與3～5年之前的數(shù)據(jù)相比，膠原蛋白碎片顯著改變。在白蛋白開始增加之前，膠原蛋白碎片就開始減少了。通過檢測相關膠原蛋白碎片，尿蛋白質組學能夠在早期階段非侵入性評估糖尿病腎病風險。

Wu等[13]目前是利用蛋白質芯片技術對2型糖尿病患者的尿蛋白質組學進行分析，去尋找新型的潛在生物標志物來對2型糖尿病腎病進行早期診斷。所用方法是采集95例分別來自2型糖尿病患者及健康對照組的尿微量白蛋白進行SELDI-TOF-MS技術分析。結合生物信息學工具，利用蛋白質芯片技術獲得超過300個從1～80 kDa的蛋白質或肽的結果。其中40個m/z從2 008.78～79 176.55 Da在2型糖尿病與對照組間存在顯著差別。2 797.03、4 545.77、4 984.03和9 083.71 Da的蛋白質被選擇作為2型糖尿病患者潛在生物標志物，其敏感性達88%，特異性達97.6%。結論：蛋白質芯片技術可以幫助發(fā)現(xiàn)新的生物標志物并可提供一種新的非侵入性工具用于早期診斷2型糖尿病。

Zhang等[14]旨在利用蛋白質組學技術識別和分析參與糖尿病腎病發(fā)展的新的蛋白質。經過分析表明，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)的合成酶2(HMGCS2)─生酮作用的關鍵酶，在2型糖尿病db/db小鼠腎臟增加了4倍。免疫組化、免疫熒光、實時PCR研究進一步證明，HMGCS2在db/db小鼠在腎小球中高度表達，對照組中低度表達。總之，這些研究表明，糖尿病患者腎臟表現(xiàn)出多余的酮活動增加與HMGCS2表達有關，糖尿病腎病中酮體生成的增加可能是其發(fā)病的一種新的機制。

4.2 糖尿病心血管疾病 糖尿病患者常發(fā)展為高血壓和動脈粥樣硬化導致心血管疾病。然而有些糖尿病患者無高血壓和冠狀動脈疾病，而發(fā)展為心力衰竭的過程稱為糖尿病性心肌病。根皮疳是一種有效的治療糖尿病的氧化劑，但對其糖尿病心肌病的心臟保護作用知之甚少。Cai等[15]在這項研究中，調查了db/db小鼠糖尿病心肌病的根皮疳保護作用。發(fā)現(xiàn)，根皮疳能顯著減少體重增加和血清空腹血糖水平(FBG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、晚期糖化終產物(AGEs)，形態(tài)學觀察表明，經根皮疳治療后正常心臟結構能夠更好地保護。使用相對和絕對定量蛋白質組學，可以確定，根皮疳可能防止糖尿病心肌病的發(fā)展。根皮疳用于治療糖尿病性心肌病可能是一種新的治療方法。

Ares等[16]對于糖尿病和高血壓對心臟的潛在協(xié)同作用表現(xiàn)出了極大的興趣，尤其是對蛋白質的病理表型和相關的肥大反應。他們培養(yǎng)正常和自發(fā)性高血壓小鼠，22周后對1型糖尿病、自發(fā)性高血壓(SHR)、自發(fā)性高血壓/1型糖尿病小鼠等使用蛋白質組學方法進行研究。蛋白質組學發(fā)現(xiàn)，長期1型糖尿病、自發(fā)性高血壓、自發(fā)性高血壓/1型糖尿病小鼠表現(xiàn)出24.53和53改變蛋白分別在不同心肌。1型糖尿病心肌表明細胞凋亡和細胞復雜蛋白的過度表達，抗凋亡和線粒體代謝酶下調。雖然關鍵的β-氧化酶并沒有激活1型糖尿病和高血壓性心肌病，但過氧化物酶增殖物激活受體α(PPARα)可能激活其他的反應。在這方面，PPARα刺激減少了如膜聯(lián)蛋白-Ⅴ在高糖和血管緊張素Ⅱ誘導了心肌細胞的肥大和肥厚因素。因此，PPARα的激活能夠反應高血壓、糖尿病心肌病的代謝轉移，凋亡增生性代償性反應。

Essop等[17]認為線粒體功能受損，可能會導致2型糖尿病/胰島素抵抗患者細胞收縮功能障礙。因此，他們致力于確定肥胖的2型糖尿病小鼠模型中線粒體蛋白質組的改變。利用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳、質譜及Mascot軟件等得出結論：細胞色素C還原酶、核心蛋白1和電子轉移核黃素蛋白亞型α-肽水平發(fā)生改變。此外，還發(fā)現(xiàn)肥胖受試者心臟的收縮蛋白協(xié)調下降，即α-平滑肌肌動蛋白、α-心肌肌動蛋白、肌球蛋白重鏈α和肌球蛋白結合蛋白C。結論：心臟收縮蛋白的下調可能與糖尿病小鼠的心臟收縮功能障礙有關。

4.3 糖尿病視網(wǎng)膜病變 Takahashi等[18]應用差異蛋白質組分析使用iTRAQ技術在2型糖尿病小鼠的相關血清蛋白中發(fā)現(xiàn)，人類的同系物SERPINA3增加了視網(wǎng)膜微血管內皮細胞滲透性。這也許是糖尿病和(或)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制。有了這些鑒別蛋白，可以提供更有價值的線索去理解糖尿病及并發(fā)癥的發(fā)病機制。

5 妊娠期糖尿病

妊娠合并糖尿病作為產科常見孕期合并癥之一，是指妊娠期出現(xiàn)的糖尿病異常。國外報道顯示，妊娠合并糖尿病發(fā)病率高達5%，而我國篩查檢出率只接近3%[19-20]。妊娠合并糖尿病對于母嬰均有嚴重不利的影響，其臨床治療越來越受到國際醫(yī)學界的關注[21]。臨床報道顯示妊娠合并糖尿病產婦母嬰并發(fā)癥發(fā)病率及病死率明顯高于正常健康產婦，特別是妊娠期未早期發(fā)現(xiàn)并進行有效血糖控制者[22]。圍產期死亡率極高。有報道提示血糖水平與早期子癇發(fā)生率呈正相關[23]。故做好臨床妊娠合并糖尿病篩查，早期診斷、早期治療，有效控制血糖水平，對于改善母嬰預后具有重要作用。

Kim等[24]設計研究的目的是確定蛋白質的生物標志物進以預測妊娠期糖尿病(GDM)的后期發(fā)展。運用表面增強激光解吸/電離飛行時間(SELDI-TOF-MS)進行蛋白質組學分析，得到結論如下：三個峰(9 122、9 412、9 701 Da)增加，被認為與載脂蛋白CⅢ亞型(17 105 Da峰值極度下降)相匹配。ELISA實驗同樣證實，GDM的婦女載脂蛋白CⅢ確實比對照組有著顯著較高水平。他們的數(shù)據(jù)表明，妊娠期糖尿病婦女母體內在16～20周時已經存在生物標志物。

6 前景

蛋白質組學研究是近年興起的研究各方面疾病的最前沿領域和熱點之一，為臨床糖尿病的研究提供了強有力的工具，展現(xiàn)出廣闊的應用前景[25]。但是相對基因組研究，它還處于初級階段，目前還難以實現(xiàn)鑒定細胞和組織的每一個蛋白質，如極酸、極堿、低豐度、難溶性蛋白質以及低拷貝數(shù)蛋白等，還未找到最佳的方法來分離；小分子蛋白檢測困難；重復性也還不夠；對于糖尿病與正常組織或細胞的差異分析，也往往缺少適合的正常組織和細胞作為對照。

總之，隨著蛋白質組學研究的不斷深入，樣本處理技術、蛋白質組分離技術、質譜技術及生物信息學的不斷發(fā)展，蛋白質組學例臨床應用越來越近，必將在糖尿病及其并發(fā)癥等疾病方面發(fā)揮巨大作用。

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Diabetes is a chronic disease in humans which is the third serious non-infectious disease to human health in a worldwide scope following cancer and cardiovascular disease.Long-term metabolic disorders of diabetes often causes damage to multiple systems leading to chronic progressive change or dysfunction and failure of heart，eyes，kidneys，nerves and blood vessels.Timely and early diagnosis and treatment of diabetes can effectively control blood sugar levels and prevent complications.With the completion of human genome project，the research field of molecular biology has transferred to the proteomics research.Proteomics is a powerful tool for evaluation of protein expression in the world，which has not yet been widely used in the study of diabetes.Through the comparison of protein expression spectra between diabetes and normal tissue，in this paper it finds new study target spot beneficial to diabetes and its complications，and it also summarizes the proteomics research technique about the pathogenesis of diabetes and its complications.

Diabetes；Proteomics；Application

2014-05-20)

1005-619X(2015)02-0126-04

10.13517/j.cnki.ccm.2015.02.006

116023沈陽軍區(qū)大連療養(yǎng)院小平島療養(yǎng)區(qū)