王　黎　盛　巍　張群英

·檢測診斷·

基于高通量技術(shù)在檢測產(chǎn)褥期婦女陰道微生態(tài)的應(yīng)用

王黎盛巍張群英

目的 采用高通量16S rDNA測序檢測產(chǎn)褥期及正常婦女陰道微生態(tài)，以更好的了解婦女在產(chǎn)褥期的陰道微生態(tài)變化。方法 采集產(chǎn)褥期婦女（產(chǎn)后6～8周）及健康育齡婦女的陰道分泌物各5例，采用高通量技術(shù)檢測其陰道微生物的種類。結(jié)果 陰道微生態(tài)菌種在產(chǎn)褥期和正常生育期差異顯著，在正常婦女的陰道中，乳桿菌屬占所有細(xì)菌含量的55%，而在產(chǎn)褥期婦女中，占22%。結(jié)論 產(chǎn)褥期婦女乳桿菌屬所占比例明顯低于正常生育期婦女，二代高通量測序技術(shù)有助于更清楚的了解陰道微生態(tài)群落的組成，以進(jìn)一步了解產(chǎn)褥期婦女陰道微生態(tài)狀況，探討產(chǎn)褥期微生態(tài)特征，可以為生殖道健康干預(yù)、臨床保健工作提供循證依據(jù)。

高通量技術(shù) 產(chǎn)褥期 陰道微生態(tài)菌群

女性陰道微生態(tài)體系是由陰道內(nèi)的微生態(tài)菌群、機(jī)體的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)功能和解剖結(jié)構(gòu)共同組成［1］。正常陰道內(nèi)有多種微生物存在，而且這種微生物生態(tài)的形成對阻止一些泌尿生殖系統(tǒng)的疾病發(fā)生起著至關(guān)重要的作用。產(chǎn)褥期婦女作為特殊群體，其陰道微生態(tài)狀況國內(nèi)外研究較少，基于顯微鏡檢查和傳統(tǒng)的培養(yǎng)法而獲得陰道微生物群落信息多樣性具有嚴(yán)重偏差，陰道微生態(tài)的評價方法中非細(xì)胞培養(yǎng)的基因技術(shù)與細(xì)菌培養(yǎng)相比有無法比擬的優(yōu)越性，為了更好的了解婦女在產(chǎn)褥期陰道微生態(tài)的變化，本資料通過采集產(chǎn)褥期婦女陰道分泌物，同時隨機(jī)挑選正常育齡婦女的陰道分泌物，提取總DNA，擴(kuò)增得到不同來源的微生物群落16S rDNA序列進(jìn)行微生物種群分類、群落結(jié)構(gòu)等初步分析。

1　臨床資料

1.1一般資料 采集自2013年9月至2014年11月產(chǎn)褥期婦女（產(chǎn)后6～8周）陰道分泌物5例為觀察組，并隨機(jī)選取同時在本院健康體檢育齡婦女的陰道分泌物5例為對照組。所有觀察對象均用長棉簽從陰道側(cè)壁上1/3處取得陰道分泌物。觀察組25～38歲，平均33.5歲。對照組年齡21～47歲，平均35歲。月經(jīng)規(guī)律，1個月內(nèi)無全身應(yīng)用抗生素及陰道局部用藥，3d內(nèi)無性生活，并知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn)同時滿足以下三項(xiàng)：⑴無臨床癥狀。⑵陰道清潔度Ⅰ～Ⅲ。⑶Nugenf評分0～3分。

1.2方法 （1）檢測：長棉簽采集的微生物檢測pH值、清潔度、膿球、滴蟲、霉菌等。（2）DNA提取：長棉簽采集的微生物懸浮于0.5ml滅菌的PBS溶液中，加入50μl溶菌酶，6μl溶菌素，3μl溶葡球菌酶和41μl TE50緩沖液，37℃消化1h，然后利用細(xì)菌基因組試劑盒提取DNA。（3）高通量16S rDNA測序及其數(shù)據(jù)分析：對細(xì)菌的V4區(qū)，利用Miseq進(jìn)行測序，擴(kuò)增引物為：F：5'-AYTGGGYDTAAAGNG-3'，R：5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'。擴(kuò)增體系為50μl。擴(kuò)增到目的條帶后進(jìn)行割膠回收，定量后，上機(jī)測序。測序所得結(jié)果根據(jù)不同的Barcode對序列的來源進(jìn)行分類，采用Flash軟件連接通過質(zhì)量控制的序列對應(yīng)的兩端序列，舍棄無連接的序列。對連接上的序列進(jìn)行過濾，獲得最終序列。應(yīng)用Qiime，根據(jù)序列的相似度，將序列歸為多個OTU。Qiime調(diào)用uclust對序列進(jìn)行聚類，選取每類最長的序列為代表序列。采用blast的方法對silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得每個OTU分類學(xué)信息。得到每個OTU的分類學(xué)信息。OTU產(chǎn)出后，統(tǒng)計(jì)各個樣品含有OTU情況及每個OTU中含有序列的數(shù)目。

2　結(jié)果

2.1陰道微生態(tài)狀況 10例就診者中，5例正常育齡婦女陰道微生態(tài)正常，5例產(chǎn)褥期婦女中1例外陰陰道假絲酵母菌病，1例為細(xì)菌性陰道病。正常育齡婦女組陰道分泌物pH值為（3.72±0.30），產(chǎn)褥期婦女組陰道分泌物pH值為（3.86±0.09），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2測序情況統(tǒng)計(jì) 采用Flash軟件，連接通過質(zhì)量控制的序列對應(yīng)的兩端序列。舍棄無法連接的序列。對連接上的序列進(jìn)行過濾（連續(xù)相同堿基＜6；模糊堿基N＜1），獲得最終用于分析的序列。陰道微生態(tài)菌種在產(chǎn)褥期和正常生育期差異顯著（P＜0.05）。應(yīng)用Qiime，根據(jù)序列的相似度＞97%的歸為一個OTU。根據(jù)OTU的數(shù)量和測序得到的序列數(shù)，做出每個樣品的稀釋曲線，從圖中發(fā)現(xiàn)在產(chǎn)褥期婦女的陰道微生物的種數(shù)要明顯多于正常生育期的婦女。為了進(jìn)一步證明此種種數(shù)的差異是否能區(qū)分產(chǎn)褥期婦女和正常生育期的婦女，采用偏最小二乘方判別分析（PLS-DA）過濾與模型分類不相關(guān)信號即正交信號，獲得PLS-DA模型，兩組樣本已經(jīng)有較明顯分離趨勢。

2.3產(chǎn)褥期和正常生育期主要的差異菌 健康婦女陰道常駐菌包括乳桿菌、假絲酵母菌、B族鏈球菌等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常婦女的陰道中，乳桿菌屬占所有細(xì)菌含量的55%，而在產(chǎn)褥期婦女中，占22%。此次試驗(yàn)中主要鑒定到的乳桿菌屬為Lactobacillus iners（正常人35%，產(chǎn)褥期0.8%），Lactobacillus crispatus（正常人8%，產(chǎn)褥期0.2%）和Lactobacillus fornicalis（正常人6%，產(chǎn)褥期0.07%）。

3　討論

本資料采用測定16rsRNA方法對正常女性及產(chǎn)褥期女性的陰道菌群進(jìn)行檢測，進(jìn)而全面、準(zhǔn)確地獲得陰道菌群的信息，結(jié)果顯示，陰道微生態(tài)菌種在產(chǎn)褥期及正常生育期差異顯著，其中產(chǎn)褥期婦女乳桿菌屬所占比例明顯低于正常生育期婦女。

陰道菌群非常復(fù)雜，常見菌種估計(jì)＞500 種，常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法僅能檢測10余種病菌，健康育齡女性陰道寄生菌以乳酸桿菌占絕對優(yōu)勢，本次采用宏基因組學(xué)方法測定正常生育期婦女陰道分泌物的檢驗(yàn)，乳桿菌屬占所有細(xì)菌含量的55%，有別于以往所說乳酸桿菌在此微生態(tài)系統(tǒng)中約占95%［2］，這要?dú)w功于宏基因組學(xué)在陰道微生態(tài)的研究應(yīng)用。

隨著近年來二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展和完善［3］，測序價格亦大幅降低，同時，測序深度也明顯增加，這有助于更清楚的了解陰道微生態(tài)群落的組成。與傳統(tǒng)測序技術(shù)相比，新一代測序技術(shù)平臺無論是測序原理、 測序過程、 適用范圍，還是測序結(jié)果均存在本質(zhì)上的不同，宏基因組學(xué)應(yīng)用于陰道微生態(tài)，在國內(nèi)尚屬領(lǐng)先水平，其檢驗(yàn)方法的應(yīng)用可使檢測定植于陰道微生物的種類更為全面、準(zhǔn)確。但是，目前尚未廣泛應(yīng)用于臨床，且本資料選擇樣本數(shù)量較少，故可能會影響產(chǎn)褥期微生物菌落的檢測準(zhǔn)確性，仍需進(jìn)一步增加標(biāo)本量進(jìn)行研究，以進(jìn)一步了解產(chǎn)褥期婦女陰道微生態(tài)狀況，探討產(chǎn)褥期微生態(tài)特征，可以為生殖道健康干預(yù)、臨床保健工作提供循證依據(jù)。

1 李蘭娟，主編.感染微生態(tài)學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，2002，421～424.

2 張卓然.臨床微生物學(xué)和微生物檢驗(yàn).第三版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003.203～206.

3 盛桂蓮，賴旭東，侯新東.古DNA實(shí)驗(yàn)體系及技術(shù).中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2009，25（2）：116～125.

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012KYB202）

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