孫鵬珍+劉月+王大可+李愛欣+王淑敏

[摘要]目的 建立裂褶菌子實體中多糖、蛋白質(zhì)含量的測定方法。 方法 采用分光光度法測定多糖和總蛋白含量，檢測波長分別為479nm和595nm。 結(jié)果 多糖濃度在0.012～0.040mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子實體多糖含量為7.26%；蛋白濃度在0.0078～0.0321mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，子實體總蛋白含量為0.2631%。 結(jié)論 本研究建立的方法簡便、快速、準確，重復性好，為裂褶菌子實體多糖和蛋白質(zhì)含量的測定提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 裂褶菌；多糖；蛋白質(zhì)；含量測定

[中圖分類號] TQ461 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2014）23-74-04

裂褶菌（Schizophyllum commne Fr.）又稱白參、樹花、八擔柴，隸屬于真菌門（Eumycophyta），擔子菌綱（Basidiomycetes），傘菌目（Agaricales），裂褶菌科（Schizophyllaceae），裂褶菌屬（Schizophyllum），食用有滋補、強身的作用[1]。近年來，日本及歐美等國在分子生物學、抗癌活性物質(zhì)和優(yōu)良菌株的選育等方面進行了廣泛的研究[2-4]，我國李夢杰等[5]對其培養(yǎng)研究并分離出了產(chǎn)漆酶的裂褶菌GGHN08-104菌株。裂褶菌子實體中含有多種活性成分，郭孟璧等[6]對裂褶菌揮發(fā)油的化學成分進行了研究，結(jié)果鑒定出（Z，Z） -9，12-十八二烯酸等12種化學成分，毛紹春等[7]用硅膠柱反復層析從子實體中分離出了麥角甾醇等多種化合物。藥用真菌目前研究最多的是真菌多糖，裂褶菌多糖可增強巨噬細胞的吞噬活性，對巨噬細胞、自然殺傷性細胞有激活作用，能提高白細胞介素產(chǎn)生能力[8]，對體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2、Bel-7402及喉癌Hep-2細胞的生長繁殖具有顯著的抑制作用[9]，所以其子實體中多糖含量可以作為裂褶菌食藥用價值高低的指標之一。王鳳仙等[10]測定出裂褶菌子實體中含有15種氨基酸，趙琪等[11]綜述裂褶菌能產(chǎn)生多種酶，所以對其蛋白質(zhì)含量測定也可以衡量其食藥用價值的高低。本研究建立了裂褶菌子實體中多糖和蛋白含量的測定方法，具有一定的理論和實際意義。

1 儀器與材料

紫外-可見分光光度計（UV2450日本島津），葡萄糖對照品、牛血清蛋白對照品（購于北京索萊寶科技有限公司），裂褶菌子實體（采于長春中醫(yī)藥大學校園）。

2 方法與結(jié)果

2.1 子實體多糖含量的測定[12]

采用3，5—二硝基水楊酸定糖法測定裂褶菌子實體中多糖的含量。

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖標準品25mg，置25mL容量瓶中加水定容至刻度，即得1mg/mL葡萄糖的標準品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 （1）供試品溶液的制備：精密稱取子實體粉末2.5081g，加熱回流提取3次，每次30min，合并濾液并濃縮，定容至50mL量瓶中，即得。作為總糖供試品和還原糖供試品備用。（2）總糖供試液的制備：精密量取供試品溶液2mL，置25mL容量瓶中，加6N鹽酸8mL，置沸水浴加熱30min，冷卻，加1滴酚酞指示劑，用40%氫氧化鈉溶液中和至微紅色，加水定容至刻度，即得總糖供試液。（3）還原糖供試液制備：即為上述供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

2.1.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取葡萄糖標品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL分別置于25mL容量瓶中，均加蒸餾水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑溶液，水浴5min，定容至刻度，搖勻。479nm波長下測定樣品吸光值。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，求得回歸方程為Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，葡萄糖在0.0120～0.0400mg/mL范內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3.2 精密度試驗 取葡萄糖對照品溶液0.7mL，置于25mL量瓶中，加蒸餾水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑溶液，水浴5min，定容至刻度，搖勻。479nm波長下連續(xù)測定6次吸光度值，RSD值為0.5981%。表明儀器精密度良好。

2.1.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液1mL，置于25mL量瓶中，加水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑溶液，水浴5min，定容至刻度，搖勻。置于479nm波長下，分別于0、0.5、1.0、1.5、2h 測定吸光度。其RSD值為0.7197%，表明供試品溶液在2h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3.4 重復性試驗 取同一子實體樣品5份，分別按照2.1.2項下方法制備供試品溶液，分別取1mL，置于25mL量瓶中，加蒸餾水至2mL，再加入1.5mL 3，5-二硝基水楊酸試劑溶液，水浴5min，定容，搖勻。置于479nm波長下測定吸光度值。其RSD值為1.0752%，表明本方法重復性良好。

2.1.3.5 加樣回收率試驗 稱取已知總糖含量的子實體粉末6份，每份約1.25 g，精密稱取，分別精密加入一定量的葡萄糖標準品，按照“2.1.2”項下制備方法制得續(xù)濾液，依法分別測總糖含量，計算加樣回收率。實驗數(shù)據(jù)見表1。結(jié)果表明，本方法葡萄糖加樣回收率RSD為0.41%，說明該方法測定裂褶菌子實體糖的含量穩(wěn)定可靠。

2.1.4 樣品含量測定 按3，5-二硝基水楊酸定糖法對樣品中總糖和還原糖進行測定，總糖減去還原糖即為多糖含量。計算出裂褶菌子實體中多糖的含量為7.26%。見表2。

2.2 蛋白質(zhì)的含量測定[13-15]endprint

采用考馬斯亮藍法測定裂褶菌子實體中蛋白質(zhì)的含量。

2.2.1 標準蛋白質(zhì)溶液的配制 精密稱定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理鹽水定容至刻度，即得2mg/mL標準蛋白質(zhì)溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取子實體粉末5.0082g，加8倍量生理鹽水浸漬24h，濾液透析濃縮，定容至10mL量瓶中，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 線性關(guān)系考察 精密加入標準蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于試管中，分別加生理鹽水至0.2mL，再加入考馬斯亮藍試劑10mL，混勻，5min后于595nm波長下測定其吸光度值。以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得回歸方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白質(zhì)在0.0078～0.0312mg/mL 范內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.2 精密度試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度，重復6次，其RSD值為0.5142%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，按照測定法每間隔5min測定其在595nm波長下吸光度，測定20min內(nèi)吸光度值的變化，其RSD值為0.5920%，表明樣品溶液在20min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3.4 重復性試驗 取子實體粉末6份，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度值，其RSD值為1.0867%，表明該方法測定蛋白質(zhì)含量重復性良好。

2.2.3.5 加樣回收率試驗 取已知蛋白質(zhì)含量的子實體粉末6份，每份約2.5g，精密稱定，分別精密加入一定量的蛋白標準品，按供試品溶液制備方法得續(xù)濾液，依法測定吸光度，計算回收率，實驗數(shù)據(jù)見表3。

2.2.3.6 樣品含量測定 對供試品溶液進行測定，按照2.2.2項下操作，平行3份，測定其吸光度值。代入標準曲線計算樣品蛋白質(zhì)含量，子實體中總蛋白含量為0.26%，結(jié)果見表4。

3 討論

裂褶菌子實體中多糖濃度在0.0120～0.040mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子實體多糖含量為7.26%；蛋白濃度在0.0078～0.0321mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子實體總蛋白含量為0.26%；本研究建立的方法簡便、快速、準確，重復性好，為裂褶菌子實體多糖和蛋白質(zhì)含量的測定提供了依據(jù)。多糖有提高免疫力等多種良好的藥理作用，所以具有良好的研究與開發(fā)前景，本實驗為開發(fā)新型藥物提供了理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州：河南科技技術(shù)出版社，2000：79.

[2] 陳慧芳.植物活性成分辭典（第一冊）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2000.

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[4] 朱泉娣.裂褶菌子實體無機元素分析[J].中草藥，1986，17（8）：17-18.

[5] 李夢杰，王翠玲，張玉金，等.裂褶菌液體和固體培養(yǎng)產(chǎn)漆酶的比較研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2011，24（6）：2311-2315.

[6] 郭孟璧，田茂軍，李聰，等.裂褶菌揮發(fā)油化學成分的研究[J].云南化工，2006，33（3）：16-27.

[7] 毛紹春，李竹英，李聰.裂褶菌化學成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19（4）：610-613.

[8] 李兆蘭.裂褶菌多糖的結(jié)構(gòu)研究[J].南京大學學報（自然科學版），1994，30（3）：482-487.

[9] 宋愛榮，王光遠，趙晨，等.裂褶菌多糖體外抑瘤試驗[R].全國藥用真菌學術(shù)研討會論文集，2008：224.

[10] 王鳳仙，夏志俊，江月仙，等.不同來源的裂褶菌子實體及發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體中氨基酸與無機元素分析[J].現(xiàn)代應用藥學，1989，6（1）：18-20.

[11] 趙琪，袁理春，李榮春.裂褶菌研究進展[J].食用菌學報，2004，11（1）：59-63.

[12] 王麗娜，陳水鈁，張兵，等. 3，5一二硝基水楊酸法測定多糖含量的研究進展[J].吉林醫(yī)藥學院學報，2009， 30（4）：232-234.

[13] 李娟，張推庭，曾偉，等.應用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學雜志，2000，13（2）：118-120.

[14] 徐杰偉，溫少磊，蔡早育.考馬斯亮藍法測定微量蛋白的條件探討[J].江西醫(yī)學檢驗，2003，21（5）：353-354.

[15] 宋景秋，王以立.雙縮脲法與考馬斯亮藍法測定母乳總蛋白的應用比較[J].臨床檢驗雜志，1997，15（2）：108.

（收稿日期：2014-09-11）endprint

采用考馬斯亮藍法測定裂褶菌子實體中蛋白質(zhì)的含量。

2.2.1 標準蛋白質(zhì)溶液的配制 精密稱定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理鹽水定容至刻度，即得2mg/mL標準蛋白質(zhì)溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取子實體粉末5.0082g，加8倍量生理鹽水浸漬24h，濾液透析濃縮，定容至10mL量瓶中，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 線性關(guān)系考察 精密加入標準蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于試管中，分別加生理鹽水至0.2mL，再加入考馬斯亮藍試劑10mL，混勻，5min后于595nm波長下測定其吸光度值。以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得回歸方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白質(zhì)在0.0078～0.0312mg/mL 范內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.2 精密度試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度，重復6次，其RSD值為0.5142%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，按照測定法每間隔5min測定其在595nm波長下吸光度，測定20min內(nèi)吸光度值的變化，其RSD值為0.5920%，表明樣品溶液在20min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3.4 重復性試驗 取子實體粉末6份，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度值，其RSD值為1.0867%，表明該方法測定蛋白質(zhì)含量重復性良好。

2.2.3.5 加樣回收率試驗 取已知蛋白質(zhì)含量的子實體粉末6份，每份約2.5g，精密稱定，分別精密加入一定量的蛋白標準品，按供試品溶液制備方法得續(xù)濾液，依法測定吸光度，計算回收率，實驗數(shù)據(jù)見表3。

2.2.3.6 樣品含量測定 對供試品溶液進行測定，按照2.2.2項下操作，平行3份，測定其吸光度值。代入標準曲線計算樣品蛋白質(zhì)含量，子實體中總蛋白含量為0.26%，結(jié)果見表4。

3 討論

裂褶菌子實體中多糖濃度在0.0120～0.040mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子實體多糖含量為7.26%；蛋白濃度在0.0078～0.0321mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子實體總蛋白含量為0.26%；本研究建立的方法簡便、快速、準確，重復性好，為裂褶菌子實體多糖和蛋白質(zhì)含量的測定提供了依據(jù)。多糖有提高免疫力等多種良好的藥理作用，所以具有良好的研究與開發(fā)前景，本實驗為開發(fā)新型藥物提供了理論依據(jù)。

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[6] 郭孟璧，田茂軍，李聰，等.裂褶菌揮發(fā)油化學成分的研究[J].云南化工，2006，33（3）：16-27.

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[8] 李兆蘭.裂褶菌多糖的結(jié)構(gòu)研究[J].南京大學學報（自然科學版），1994，30（3）：482-487.

[9] 宋愛榮，王光遠，趙晨，等.裂褶菌多糖體外抑瘤試驗[R].全國藥用真菌學術(shù)研討會論文集，2008：224.

[10] 王鳳仙，夏志俊，江月仙，等.不同來源的裂褶菌子實體及發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體中氨基酸與無機元素分析[J].現(xiàn)代應用藥學，1989，6（1）：18-20.

[11] 趙琪，袁理春，李榮春.裂褶菌研究進展[J].食用菌學報，2004，11（1）：59-63.

[12] 王麗娜，陳水鈁，張兵，等. 3，5一二硝基水楊酸法測定多糖含量的研究進展[J].吉林醫(yī)藥學院學報，2009， 30（4）：232-234.

[13] 李娟，張推庭，曾偉，等.應用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學雜志，2000，13（2）：118-120.

[14] 徐杰偉，溫少磊，蔡早育.考馬斯亮藍法測定微量蛋白的條件探討[J].江西醫(yī)學檢驗，2003，21（5）：353-354.

[15] 宋景秋，王以立.雙縮脲法與考馬斯亮藍法測定母乳總蛋白的應用比較[J].臨床檢驗雜志，1997，15（2）：108.

（收稿日期：2014-09-11）endprint

采用考馬斯亮藍法測定裂褶菌子實體中蛋白質(zhì)的含量。

2.2.1 標準蛋白質(zhì)溶液的配制 精密稱定20mg牛血清蛋白，置于10mL的容量瓶中，用生理鹽水定容至刻度，即得2mg/mL標準蛋白質(zhì)溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取子實體粉末5.0082g，加8倍量生理鹽水浸漬24h，濾液透析濃縮，定容至10mL量瓶中，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 線性關(guān)系考察 精密加入標準蛋白溶液0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16mL于試管中，分別加生理鹽水至0.2mL，再加入考馬斯亮藍試劑10mL，混勻，5min后于595nm波長下測定其吸光度值。以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得回歸方程：Y=20.0830X+0.1451，r=0.9997，蛋白質(zhì)在0.0078～0.0312mg/mL 范內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.2 精密度試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度，重復6次，其RSD值為0.5142%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，按照測定法每間隔5min測定其在595nm波長下吸光度，測定20min內(nèi)吸光度值的變化，其RSD值為0.5920%，表明樣品溶液在20min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.3.4 重復性試驗 取子實體粉末6份，按照2.2.2項下制備，移取0.2mL溶液，依法在595nm波長下測定其吸光度值，其RSD值為1.0867%，表明該方法測定蛋白質(zhì)含量重復性良好。

2.2.3.5 加樣回收率試驗 取已知蛋白質(zhì)含量的子實體粉末6份，每份約2.5g，精密稱定，分別精密加入一定量的蛋白標準品，按供試品溶液制備方法得續(xù)濾液，依法測定吸光度，計算回收率，實驗數(shù)據(jù)見表3。

2.2.3.6 樣品含量測定 對供試品溶液進行測定，按照2.2.2項下操作，平行3份，測定其吸光度值。代入標準曲線計算樣品蛋白質(zhì)含量，子實體中總蛋白含量為0.26%，結(jié)果見表4。

3 討論

裂褶菌子實體中多糖濃度在0.0120～0.040mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=23.0753X-0.1733，r=0.9998，子實體多糖含量為7.26%；蛋白濃度在0.0078～0.0321mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=20.0830x+0.1451，r=0.9997，子實體總蛋白含量為0.26%；本研究建立的方法簡便、快速、準確，重復性好，為裂褶菌子實體多糖和蛋白質(zhì)含量的測定提供了依據(jù)。多糖有提高免疫力等多種良好的藥理作用，所以具有良好的研究與開發(fā)前景，本實驗為開發(fā)新型藥物提供了理論依據(jù)。

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[5] 李夢杰，王翠玲，張玉金，等.裂褶菌液體和固體培養(yǎng)產(chǎn)漆酶的比較研究[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2011，24（6）：2311-2315.

[6] 郭孟璧，田茂軍，李聰，等.裂褶菌揮發(fā)油化學成分的研究[J].云南化工，2006，33（3）：16-27.

[7] 毛紹春，李竹英，李聰.裂褶菌化學成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19（4）：610-613.

[8] 李兆蘭.裂褶菌多糖的結(jié)構(gòu)研究[J].南京大學學報（自然科學版），1994，30（3）：482-487.

[9] 宋愛榮，王光遠，趙晨，等.裂褶菌多糖體外抑瘤試驗[R].全國藥用真菌學術(shù)研討會論文集，2008：224.

[10] 王鳳仙，夏志俊，江月仙，等.不同來源的裂褶菌子實體及發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體中氨基酸與無機元素分析[J].現(xiàn)代應用藥學，1989，6（1）：18-20.

[11] 趙琪，袁理春，李榮春.裂褶菌研究進展[J].食用菌學報，2004，11（1）：59-63.

[12] 王麗娜，陳水鈁，張兵，等. 3，5一二硝基水楊酸法測定多糖含量的研究進展[J].吉林醫(yī)藥學院學報，2009， 30（4）：232-234.

[13] 李娟，張推庭，曾偉，等.應用考馬斯亮藍法測定總蛋白含量[J].中國生物制品學雜志，2000，13（2）：118-120.

[14] 徐杰偉，溫少磊，蔡早育.考馬斯亮藍法測定微量蛋白的條件探討[J].江西醫(yī)學檢驗，2003，21（5）：353-354.

[15] 宋景秋，王以立.雙縮脲法與考馬斯亮藍法測定母乳總蛋白的應用比較[J].臨床檢驗雜志，1997，15（2）：108.

（收稿日期：2014-09-11）endprint