林鋒　劉莉　曹錚　等

摘要：從患病中華鱉（Pelodiscus sinensis）肺組織中分離到優(yōu)勢菌1株，進行了表型特征分析和16S rDNA序列測定。結(jié)果表明，該菌為氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila），通過對健康中華鱉進行人工感染，發(fā)現(xiàn)該菌具有致病性；選取20種常規(guī)藥敏試紙進行藥敏試驗，結(jié)果表明，該嗜水氣單胞菌對慶大霉素、頭孢他啶、頭孢西丁、鏈霉素、呋喃妥因敏感，對諾氟沙星、紅霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星中敏，對其他11種抗生素具有耐藥性。

關(guān)鍵詞：鱉（Pelodiscus sinensis）；嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）；16S rDNA；藥敏試驗

中圖分類號：S943 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5487-03

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于弧菌科氣單胞菌屬，是一種條件性致病菌，廣泛存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，對水產(chǎn)動物、畜禽和人類均有致病性[1]。嗜水氣單胞菌作為淡水養(yǎng)殖動物重要的病原菌之一，目前已確定淡水魚類細菌性敗血癥、鱉“紅底板”病等多種病害是由其所導(dǎo)致的[2，3]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。近年來，抗生素的普遍使用導(dǎo)致了嗜水氣單胞菌的耐藥性也日趨嚴重[4]。因此，本研究通過對患病中華鱉（Pelodiscus sinensis）體內(nèi)的病原菌分離、16S rDNA序列分析來鑒定病原菌的類別，并利用藥敏試驗來初步篩選治療該病癥的藥物，開展典型性中華鱉病癥的研究，有利于針對不同的病癥采取有效的治療措施，降低經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2013年4月，取自浙江省湖州市南潯區(qū)某中華鱉養(yǎng)殖場外塘，病鱉體重為820 g左右。臨床癥狀為頸部腫大，腹部有氣脹感；部分嚴重者口鼻出血。病理剖檢發(fā)現(xiàn)肺腫大，部分呈粉紅色；肝脾略有腫大，有的呈花斑狀；咽喉上皮處有顆粒狀的突起。從開始發(fā)現(xiàn)到陸續(xù)性死亡時間為7～15 d，累積死亡率近70%。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 營養(yǎng)肉湯干粉、瓊脂干粉、細菌理化特性鑒定用的培養(yǎng)基和藥敏試紙購自杭州天和微生物公司； 革蘭氏染液購自南京建成生物工程研究所；PCR擴增試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離 在無菌條件下，用酒精棉球擦拭患病鱉體表后進行解剖，取血、心、肝、脾和腸等組織樣品，分別在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板（pH 7.4）上劃線培養(yǎng)，28 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，根據(jù)菌落特征，挑取單菌落劃線分離。

1.2.2 細菌形態(tài)觀察 將分離菌接種于培養(yǎng)基平板上，置于 28 ℃培養(yǎng)12 h，取菌體涂片，革蘭氏染色后用光學顯微鏡觀察菌體形態(tài)和染色特征。

1.2.3 致病性試驗 將分離菌接種于液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中，置于28 ℃振蕩培養(yǎng)6 h，取菌體涂片鏡檢，確認純度后低速離心收集沉淀，加入滅菌生理鹽水制成細菌懸液。取6只中華鱉分為試驗組和對照組，每組 3只。試驗組每只鱉肌肉注射0.5 mL 細菌懸液（濃度約為1×109 CFU/mL）；對照組每只注射0.5 mL生理鹽水，分別隔離飼養(yǎng)，記錄發(fā)病和死亡情況。

1.2.4 16S rDNA序列測定 16S rDNA基因序列的擴增采用細菌通用引物，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R： 5′-TACGGTTACCTT GTTACGACTT-3′。擴增片段大小約1 470 bp。PCR擴增反應(yīng)體系：10×Buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，10 μmol/L引物各1 μL，5 U/μL Taq酶 0.5 μL，模板菌液3 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR擴增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將陽性克隆送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行核苷酸序列測定。

1.2.5 藥敏試驗 藥物敏感性試驗按紙片擴散法[5]進行，測定抑菌圈直徑，并參照NCCLS判斷標準[6]進行敏感性判定。檢測的抗生素包括青霉素G、頭孢他啶、頭孢西丁、復(fù)達欣、萬古霉素、慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素、阿米卡星、強力霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、呋喃妥因、呋喃唑酮、諾氟沙星和環(huán)丙沙星等20種。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的形態(tài)特征

從患病的中華鱉肺組織中分離到一種優(yōu)勢菌，標記為J。細菌J染色后呈紅色，短桿狀，兩端鈍圓，直形或弧形，單個或成對排列，初步判定為革蘭氏陰性短桿菌（圖1）。

2.2 細菌致病性試驗

健康中華鱉接種細菌J的懸液。接種后12 d對照組正常，而感染組則出現(xiàn)死亡。對死亡鱉進行分菌培養(yǎng)，經(jīng)染色、鏡檢為相同菌株。結(jié)果表明，分離菌J具有致病性，且感染中華鱉后出現(xiàn)典型性特征即肺腫大（圖2）。

2.3 細菌16S rDNA序列鑒定

利用16S rDNA通用引物進行PCR擴增（圖3），獲得了菌株的核苷酸序列。將核苷酸測序結(jié)果通過BLAST比對，發(fā)現(xiàn)菌株J與GenBank上收錄的嗜水氣單胞菌同源性高達99%，根據(jù)細菌J的表型特征和生理生化特性，可以判定細菌J與嗜水氣單胞菌為同一屬的細菌。

2.4 藥敏試驗

選取常用的20種抗生素藥敏紙片，對嗜水氣單胞菌J進行藥敏試驗。結(jié)果（表1）表明，嗜水氣單胞菌J對慶大霉素、頭孢他啶、頭孢西丁、鏈霉素、呋喃妥因敏感，對諾氟沙星、紅霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星中敏，對其他11種抗生素有耐藥性。

3 小結(jié)與討論

本研究從采集到的中華鱉病樣中分離到單一優(yōu)勢菌株，經(jīng)革蘭氏染色進行表型分析，結(jié)合目前正逐步廣泛用于養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落的分析和病原菌鑒定的16S rDNA通用引物PCR擴增法[7，8]，較快速、準確地判定該菌株為嗜水氣單胞菌。通過細菌回感試驗，發(fā)現(xiàn)該菌有致病性，且所引起的病癥具有典型性即肺部腫大、發(fā)紅。而藥敏試驗結(jié)果表明，這種菌有較強的耐藥性。到目前為止，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氣單胞菌作為條件致病菌，能夠產(chǎn)生腸毒素、壞死毒素、溶血素等細胞外毒素[9-11]，從而引發(fā)中華鱉多種疾病[12-17]。由于嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，每種之間對不同種的抗生素敏感性差異較大，因此必須針對性篩選高敏藥物。本研究中分離到的菌株所引起的中華鱉肺組織腫大壞死癥具有發(fā)病快、持續(xù)性死亡的特征，且死亡率達到70%左右，屬于高致病菌株，對其研究有利于為診斷和治療提供科學依據(jù)。

參考文獻：

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[17] 孫紅祥，舒妙安.中華鱉幾種常見疾病病原的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)學報，2002，22（2）：140-142.

（責任編輯 屠 晶）

3 小結(jié)與討論

本研究從采集到的中華鱉病樣中分離到單一優(yōu)勢菌株，經(jīng)革蘭氏染色進行表型分析，結(jié)合目前正逐步廣泛用于養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落的分析和病原菌鑒定的16S rDNA通用引物PCR擴增法[7，8]，較快速、準確地判定該菌株為嗜水氣單胞菌。通過細菌回感試驗，發(fā)現(xiàn)該菌有致病性，且所引起的病癥具有典型性即肺部腫大、發(fā)紅。而藥敏試驗結(jié)果表明，這種菌有較強的耐藥性。到目前為止，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氣單胞菌作為條件致病菌，能夠產(chǎn)生腸毒素、壞死毒素、溶血素等細胞外毒素[9-11]，從而引發(fā)中華鱉多種疾病[12-17]。由于嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，每種之間對不同種的抗生素敏感性差異較大，因此必須針對性篩選高敏藥物。本研究中分離到的菌株所引起的中華鱉肺組織腫大壞死癥具有發(fā)病快、持續(xù)性死亡的特征，且死亡率達到70%左右，屬于高致病菌株，對其研究有利于為診斷和治療提供科學依據(jù)。

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[16] 丁 雷，岳永生，宋憬愚.鱉白底板病腐皮病并發(fā)癥病原菌及藥物治療[J].淡水漁業(yè)，2001，31（1）：46-48.

[17] 孫紅祥，舒妙安.中華鱉幾種常見疾病病原的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)學報，2002，22（2）：140-142.

（責任編輯 屠 晶）

3 小結(jié)與討論

本研究從采集到的中華鱉病樣中分離到單一優(yōu)勢菌株，經(jīng)革蘭氏染色進行表型分析，結(jié)合目前正逐步廣泛用于養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落的分析和病原菌鑒定的16S rDNA通用引物PCR擴增法[7，8]，較快速、準確地判定該菌株為嗜水氣單胞菌。通過細菌回感試驗，發(fā)現(xiàn)該菌有致病性，且所引起的病癥具有典型性即肺部腫大、發(fā)紅。而藥敏試驗結(jié)果表明，這種菌有較強的耐藥性。到目前為止，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氣單胞菌作為條件致病菌，能夠產(chǎn)生腸毒素、壞死毒素、溶血素等細胞外毒素[9-11]，從而引發(fā)中華鱉多種疾病[12-17]。由于嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，每種之間對不同種的抗生素敏感性差異較大，因此必須針對性篩選高敏藥物。本研究中分離到的菌株所引起的中華鱉肺組織腫大壞死癥具有發(fā)病快、持續(xù)性死亡的特征，且死亡率達到70%左右，屬于高致病菌株，對其研究有利于為診斷和治療提供科學依據(jù)。

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[9] ROSSI O D， AMARAL L A， NADER A，et al. Enterotoxigenicity of Aeromonas sp strains isolated from differents points in the cattle slaughter ing processing line[J]. Arq Br as Med Vet Zoo ，2001， 53（5）：589-594.

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（責任編輯 屠 晶）