李軍　潘艷　陳澤祥　等

摘要：應用Garnier-Robson法和Chou-Fasman法分析羊種布魯氏菌NN1202株VirB8蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉角區(qū)域和卷曲區(qū)域；應用Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Emini法和Jameson-Wolf法分析蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區(qū)域、溶劑表面可及性和抗原指數(shù)。對各方法的結果綜合分析，VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸區(qū)域可能是優(yōu)勢B細胞抗原表位。

關鍵詞：布魯氏菌；VirB8；抗原表位

中圖分類號：S858.26；S852.61+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）22-5467-03

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種以人和動物出現(xiàn)流產、不育和發(fā)熱為臨床特征的人獸共患細菌病，在中國人、畜間仍有該病的發(fā)生，給人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來嚴重危害[1]。布魯氏菌是一種兼性細胞內寄生的細菌，動物感染后常呈隱性，往往到性成熟或妊娠時才表現(xiàn)典型的臨床癥狀，對布魯氏菌早期感染的檢測是有效防控布魯氏菌病的關鍵?，F(xiàn)在用于布魯氏菌病檢測的主要方法是虎紅平板凝集（RBT）和試管凝集試驗（SAT），但其存在著靈敏度低和非特異性的缺點，因此，建立一種敏感性高、特異性強的ELISA方法具有重要的意義。

VirB8蛋白是布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)的一個早期分泌蛋白[2]，鐘旗等[3]的研究表明，缺失VirB8基因的豬種布魯氏菌變異株感染BALB/c小鼠后，可保護小鼠抵抗親本細菌的攻擊，證實VirB8基因與布魯氏菌毒力密切相關。VirB8基因同源性比較表明，其在布魯氏菌種間的同源性高度保守[4]，因此，VirB8基因可以作為布魯氏菌基因缺失疫苗、鑒別診斷方法的一個靶基因。張劍等[5]對牛種布魯氏菌VirB8基因進行原核表達后，以表達的蛋白作為包被抗原建立的間接ELISA方法與虎紅平板凝集試驗的符合率達97.02%，證明了以VirB8蛋白作為包被蛋白建立間接ELISA的可行性。但是，原核表達蛋白存在著蛋白純化、生產成本高等缺點，而以抗原表位序列為基礎的人工合成抗原多肽有效解決了這些問題。本研究擬對羊種布魯氏菌VirB8蛋白的B細胞抗原表位進行分析，為后續(xù)VirB8蛋白的抗原多肽合成提供信息。

1 材料與方法

1.1 羊種布魯氏菌NN1202株VirB8基因序列

羊種布魯氏菌NN1202株VirB8基因序列為本實驗室擴增、測序所得[4]?；蛐蛄幸呀浀卿汵CBI GenBank，登錄號JQ768413。以此基因的推導氨基酸序列為研究對象進行VirB8蛋白的B細胞抗原表位分析。

1.2 VirB8蛋白二級結構分析

應用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析VirB8蛋白的α-螺旋、β-折疊、轉角區(qū)域和卷曲區(qū)域[6，7]。

1.3 VirB8蛋白B細胞抗原表位分析

運用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析VirB8蛋白的氨基酸親水性、蛋白柔性區(qū)域、溶劑表面可及性和抗原指數(shù)，綜合各方法的結果并結合B細胞表位網上VirB8蛋白的B細胞抗原表位預測進行綜合分析[8-11]。

2 結果與分析

2.1 VirB8蛋白二級結構分析

綜合Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法的分析，VirB8蛋白有4個α-螺旋區(qū)域（25-33、36-39、41-45、64-73位氨基酸）；7個β-折疊區(qū)域（52-64、73-82、107-116、160-169、172-186、193-207、235-239位氨基酸）。在α-螺旋和β-折疊區(qū)域的間隙分布著長短不一的9個轉角區(qū)域和11個卷曲區(qū)域（圖1）。

2.2 VirB8蛋白的氨基酸親水性分析

Kyte-Doolittle方法（圖2）分析表明，VirB8蛋白有2-22、37-45、93-97、116-127、135-158、181-196、229-233等7個氨基酸親水性區(qū)域（≥0.5）。

2.3 VirB8蛋白的柔性區(qū)域分析

Karplus-Schulz方法（圖3）分析表明，VirB8蛋白有多個柔性區(qū)域，主要位于4-22、38-43、79-87、89-96、115-116、123-127、134-142、144-162、169-178、182-196、213-221和231-235位氨基酸區(qū)域。

2.4 VirB8蛋白的溶劑表面可及性分析

Emini方法（圖4）分析表明，3-16、39-43、91-97、100-107、115-127、134-141、145-155、181-195和229-232位氨基酸區(qū)域出現(xiàn)在VirB8蛋白溶劑表面可及性較大（≥1）。

2.5 VirB8蛋白的抗原指數(shù)分析

Jameson-Wolf方法（圖5）分析表明，VirB8蛋白抗原指數(shù)較高的區(qū)域（≥0）有：1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸區(qū)域，以C端區(qū)域的抗原指數(shù)較高，跨度較大，存在抗原表位的可能性也較大。

2.6 VirB8蛋白B細胞表位綜合分析

應用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法并結合B細胞表位網上預測分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/），VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸區(qū)域具有較好的親水性、柔性和溶劑表面可及性，抗原指數(shù)也較高，結合蛋白二級結構上含有容易形成抗原表位的轉角和卷曲區(qū)域，因此，這些區(qū)域極有可能是VirB8蛋白的優(yōu)勢B細胞抗原表位。

3 討論

布魯氏菌IV分泌系統(tǒng)是由VirB1—VirB12共12個蛋白構成的一類分泌系統(tǒng)。布魯氏菌侵入宿主吞噬細胞后，VirB蛋白在布氏小體運輸?shù)骄W狀內皮系統(tǒng)的過程中，能阻止溶酶體與布氏小體的融合，起到免疫逃避作用[12，13]。因此，VirB蛋白作為一種布魯氏菌早期分泌蛋白，可以是布魯氏菌病早期診斷的靶蛋白。在布魯氏菌病診斷中，傳統(tǒng)的RBT和SAT方法的靈敏度低，特異性不強。1976年，Carlesson HE首次將ELISA方法應用于牛種布魯氏菌病的檢測，其敏感性比SAT方法敏感10～100倍[14]。在世界動物衛(wèi)生組織（OIE）對布魯氏菌病的檢測方法中，已經將ELISA方法列為血清學檢測方法。

通過生物信息學技術對蛋白的二級結構和B細胞抗原表位進行分析是人工合成多肽的基礎[15]。蛋白的二級結構決定了B細胞抗原表位的形成，蛋白多肽鏈中的α-螺旋和β-折疊形成穩(wěn)定的剛性結構，在蛋白內部中起著“支撐”作用，成為B細胞抗原表位的概率低；而轉角和卷曲區(qū)域屬于“柔性”結構，暴露在蛋白表面，與抗體結合的幾率大，成為B細胞抗原表位的可能性高[16]。此外，氨基酸的親水性、極性也決定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的親水部位和溶劑表面可及性也與B細胞抗原表位有密切關系。

蛋白二級結構分析、氨基酸親水性分析、蛋白柔性區(qū)域分析、溶劑表面可及性分析是目前常用的B細胞抗原表位的分析方法[6-10]。1998年，Jamson和Wolf對此進行了改良，以蛋白二級結構分析占40%、氨基酸親水性分析占30%、蛋白柔性區(qū)域分析占15%、溶劑表面可及性分析占15%的計算模式，提出一種抗原指數(shù)分析法[11]。根據(jù)該方法分析，VirB8蛋白的1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸區(qū)域存在抗原表位的可能性較大，但由于蛋白在形成立體構象時，蛋白表面的氨基酸會遮蓋一些抗原指數(shù)較高的區(qū)域，使其不能成為優(yōu)勢抗原表位，因此，根據(jù)綜合分析，人們選擇VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸區(qū)域作為后續(xù)多肽抗原研究的靶位點。

參考文獻：

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學[M].第五版.北京：中國農業(yè)出版社，2006.

[2] ROUOT B， ALVAREZ-MARTINEZ M T， MARIUS C. Production of the type IV secretion system differs among Brucella species as revealed with VirB5-and VirB8-specific antisera [J]. Infection and Immunity， 2003， 71： 1075-1082.

[3] 鐘 旗，何倩倪，范偉興，等.布魯氏菌VirB8變異株的構建及其感染力和毒力的測定[J].畜牧獸醫(yī)學報，2009，40（6）：892-897.

[4] 李 軍，陳澤祥，楊 威，等.廣西家畜布魯氏菌病的監(jiān)測分析[J].中國人獸共患病學報，2012，28（7）：754-758.

[5] 張 劍，馬衛(wèi)明，張 亮，等.牛布魯氏菌毒力基因Virb8間接ELISA檢測方法的建立與應用[J].中國農業(yè)科學，2013，46（16）：3460-3469.

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[13] NAROENI A，JOUY N，OUAHRANI-BETTACHE S， et al. Brucella suis-impaired specific recognition of phagosomes by lysosomes due to phagosomal membrane modifications[J]. Infect Immun，2001，69（1）：486-493.

[14] CARLESSON H E， HURVELL B， LINDBERG A A. Enzyme-linkerd immunosorbent assay for titration of antibodies against Brucella abortus and Yersinia enterocolitica[J]. Acta Pathol Microbiol Scand C， 1976， 84（3）： 168-176.

[15] 張洪勇，金寧一.合成肽疫苗的分子設計[J].生物技術通訊，2003，14（2）：145-147.

[16] 來魯華.蛋白質的結構預測與分子設計[M].北京：北京大學出版社，1993.

（責任編輯 程碧軍）

3 討論

布魯氏菌IV分泌系統(tǒng)是由VirB1—VirB12共12個蛋白構成的一類分泌系統(tǒng)。布魯氏菌侵入宿主吞噬細胞后，VirB蛋白在布氏小體運輸?shù)骄W狀內皮系統(tǒng)的過程中，能阻止溶酶體與布氏小體的融合，起到免疫逃避作用[12，13]。因此，VirB蛋白作為一種布魯氏菌早期分泌蛋白，可以是布魯氏菌病早期診斷的靶蛋白。在布魯氏菌病診斷中，傳統(tǒng)的RBT和SAT方法的靈敏度低，特異性不強。1976年，Carlesson HE首次將ELISA方法應用于牛種布魯氏菌病的檢測，其敏感性比SAT方法敏感10～100倍[14]。在世界動物衛(wèi)生組織（OIE）對布魯氏菌病的檢測方法中，已經將ELISA方法列為血清學檢測方法。

通過生物信息學技術對蛋白的二級結構和B細胞抗原表位進行分析是人工合成多肽的基礎[15]。蛋白的二級結構決定了B細胞抗原表位的形成，蛋白多肽鏈中的α-螺旋和β-折疊形成穩(wěn)定的剛性結構，在蛋白內部中起著“支撐”作用，成為B細胞抗原表位的概率低；而轉角和卷曲區(qū)域屬于“柔性”結構，暴露在蛋白表面，與抗體結合的幾率大，成為B細胞抗原表位的可能性高[16]。此外，氨基酸的親水性、極性也決定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的親水部位和溶劑表面可及性也與B細胞抗原表位有密切關系。

蛋白二級結構分析、氨基酸親水性分析、蛋白柔性區(qū)域分析、溶劑表面可及性分析是目前常用的B細胞抗原表位的分析方法[6-10]。1998年，Jamson和Wolf對此進行了改良，以蛋白二級結構分析占40%、氨基酸親水性分析占30%、蛋白柔性區(qū)域分析占15%、溶劑表面可及性分析占15%的計算模式，提出一種抗原指數(shù)分析法[11]。根據(jù)該方法分析，VirB8蛋白的1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸區(qū)域存在抗原表位的可能性較大，但由于蛋白在形成立體構象時，蛋白表面的氨基酸會遮蓋一些抗原指數(shù)較高的區(qū)域，使其不能成為優(yōu)勢抗原表位，因此，根據(jù)綜合分析，人們選擇VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸區(qū)域作為后續(xù)多肽抗原研究的靶位點。

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（責任編輯 程碧軍）

3 討論

布魯氏菌IV分泌系統(tǒng)是由VirB1—VirB12共12個蛋白構成的一類分泌系統(tǒng)。布魯氏菌侵入宿主吞噬細胞后，VirB蛋白在布氏小體運輸?shù)骄W狀內皮系統(tǒng)的過程中，能阻止溶酶體與布氏小體的融合，起到免疫逃避作用[12，13]。因此，VirB蛋白作為一種布魯氏菌早期分泌蛋白，可以是布魯氏菌病早期診斷的靶蛋白。在布魯氏菌病診斷中，傳統(tǒng)的RBT和SAT方法的靈敏度低，特異性不強。1976年，Carlesson HE首次將ELISA方法應用于牛種布魯氏菌病的檢測，其敏感性比SAT方法敏感10～100倍[14]。在世界動物衛(wèi)生組織（OIE）對布魯氏菌病的檢測方法中，已經將ELISA方法列為血清學檢測方法。

通過生物信息學技術對蛋白的二級結構和B細胞抗原表位進行分析是人工合成多肽的基礎[15]。蛋白的二級結構決定了B細胞抗原表位的形成，蛋白多肽鏈中的α-螺旋和β-折疊形成穩(wěn)定的剛性結構，在蛋白內部中起著“支撐”作用，成為B細胞抗原表位的概率低；而轉角和卷曲區(qū)域屬于“柔性”結構，暴露在蛋白表面，與抗體結合的幾率大，成為B細胞抗原表位的可能性高[16]。此外，氨基酸的親水性、極性也決定了其是否暴露在蛋白表面，因此，蛋白的親水部位和溶劑表面可及性也與B細胞抗原表位有密切關系。

蛋白二級結構分析、氨基酸親水性分析、蛋白柔性區(qū)域分析、溶劑表面可及性分析是目前常用的B細胞抗原表位的分析方法[6-10]。1998年，Jamson和Wolf對此進行了改良，以蛋白二級結構分析占40%、氨基酸親水性分析占30%、蛋白柔性區(qū)域分析占15%、溶劑表面可及性分析占15%的計算模式，提出一種抗原指數(shù)分析法[11]。根據(jù)該方法分析，VirB8蛋白的1-19、21-25、35-45、83-87、89-98、100-107、115-129、134-141、145-160、170-176、179-196、211-218、229-236位氨基酸區(qū)域存在抗原表位的可能性較大，但由于蛋白在形成立體構象時，蛋白表面的氨基酸會遮蓋一些抗原指數(shù)較高的區(qū)域，使其不能成為優(yōu)勢抗原表位，因此，根據(jù)綜合分析，人們選擇VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸區(qū)域作為后續(xù)多肽抗原研究的靶位點。

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（責任編輯 程碧軍）