陳衛(wèi)豐

湖南省益陽市中心醫(yī)院皮膚科，湖南益陽 413000

CD4+CD25+調節(jié)性T 細胞（Treg 細胞）對機體發(fā)揮免疫調節(jié)功能方面起非常重要的作用，如維持免疫自穩(wěn)、調控免疫應答等。 研究表明，由人類乳頭瘤病毒（HPV）引起的尖銳濕疣（CA）與其細胞免疫功能相對不足密切相關，CD4+CD25+Treg 細胞調控機體對病毒感染的免疫應答主要通過抑制效應細胞的增殖和抑制細胞因子分泌，CD4+CD25+FOXP3+Treg 細胞的局部聚集可能是皮損的CA 實現(xiàn)免疫逃逸的機制之一[1]。近年來，局部的44℃溫熱治療被成功地應用于不同型別的HPV 感染，可能通過促進朗格漢斯細胞（LC）的遷移和成熟，在局部細胞免疫應答中發(fā)揮作用[2]。本研究通過動態(tài)檢測35 例CA 患者在44℃溫熱治療前后CD4+CD25+Treg 的表達及在調節(jié)性T 細胞分化發(fā)育和功能維持中起重要作用的轉錄因子Foxp3 以及負性協(xié)同刺激分子，如程序性死亡分子配體（PD-L）、細胞毒T 細胞相關抗原4（CTLA-4）和腫瘤壞死因子受體（GITR）等的表達水平，以及CD4+CD25+Treg 細胞內分泌的抑制性細胞因子白介素-10（IL-10）和轉化生長因子-β（TGF-β）的陽性細胞百分比，探討44℃溫熱對CA 患者機體免疫功能的影響及可能作用機制，為溫熱治療尖銳濕疣提供新的理論依據(jù)和新的治療靶點。

1 對象與方法

1.1 對象

選取2013 年1 月～2015 年4 月益陽市中心醫(yī)院皮膚科門診就診的經臨床確診的CA 患者35 例，均無復發(fā)性CA 病史，35 例受試者疣體數(shù)目≥5 個或單個直徑≥2 cm，符合2000 年原衛(wèi)生部防疫司制訂的CA 診斷標準[3]，其中男15 例，女20 例；年齡18～60 歲，平均（37.45±10.58）歲；病程0.1～30 個月，平均（9.63±3.51）個月。 選取正常人作為對照組，共35 例，其中男17 例，女18 例，年齡18～58 歲，平均（30.78±9.41）歲。所有研究對象近2 個月內沒有使用過任何免疫調節(jié)的相關藥物，排除全身衰竭、結核、肝腎疾病、腫瘤、器官移植及其他免疫性疾病。 各組間年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），具有可比性。所有標本的收集均經其本人或家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 治療方法

應用中國醫(yī)科大學自主研制的溫熱治療儀（專利號ZL200720185403.3），選取靶疣進行局部44℃溫熱治療，連續(xù)治療4 d，每次60 min，1 次/d；間隔7～10 d，再連續(xù)治療3 d；間隔7～10 d，再連續(xù)治療2 d；此后每隔7～10 d 進行1 次治療，直至疣體消退。 3 個月時觀察臨床療效。

1.3 研究方法

1.3.1 試劑和儀器 CD4-FITC 單克隆鼠抗人抗體，CD25-PE 單克隆鼠抗人抗體及同型對照IgG1-FITC，IgG1-PE，PD-L-FITC單克隆鼠抗人抗體、CTLA-4（CD152）-PE 單克隆鼠抗人抗體及同型對照小鼠IgG1、IgG2α抗 體 和PE 標 記 的 抗 人Foxp3 胞 內 染 色 試劑盒均購自eBioscience 公司。 流式細胞儀為Beckman公司產品（型號：EPICS-XL）。 人IL-10、人TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒為eBiosource 公司產品。淋巴細胞分離液（AXIS-SHIELD 公司）。MagCellectTM人CD4+CD25+Treg 細胞免疫磁珠分選試劑盒購自R&D 公司。

1.3.2 CD4+CD25+T 細胞的分離純化 用90 μL 緩沖液調整外周血單個核細胞（PBMC）為1×108/mL，再加入CD25 磁珠標記抗人CD25 單抗10 μL，置4℃冰箱孵育15 min，過MS 柱分選，收集流下來的細胞懸液和洗柱液，陽性選擇獲得CD4+CD25+Treg 細胞，重復上述操作，以增加細胞的純度。經流式細胞儀分析，其純度＞85%。

1.3.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞染色 采用淋巴細胞分離液（AXIS-SHIELD 公司）經密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，用含10%的小牛血清的培養(yǎng)基RPMI 1640 調細胞至1×106/mL，取200 μL 細胞懸液加入抗CD4-PE、CD25-FITC 單克隆抗體各20 μL，同型對照分別為IgG1-FITC，IgG1-PE，混勻，室溫避光孵育20～30 min，加2 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2 次，4℃，1500 r/min 離心5 min，棄上清，加2%正常大鼠血清100 μL，避光封閉20 min，以減少非特異性熒光吸附，再加入PE 標記抗人Foxp3 抗體10 μL，避光孵育20～30 min，加2 mL PBS 緩沖液洗滌2 次，將細胞懸浮于0.5 mL PBS 洗滌液中，振蕩混勻后上機檢測。1.3.4 CD4+CD25+Treg 細胞膜分子熒光染色 采用全血熒光抗體直接染色法[3]，取2 管EDTA 抗凝全血100 μL，置12 mm×75 mm 專用塑料試管中， 加入20 μL 特異性熒光單抗，另一份加入熒光標記的無關單抗作為同型對照，室溫下避光染色15 min。 然后加入溶血素2 mL 溶解紅細胞、穩(wěn)定和固定白細胞，靜置5 min，4℃，1500 r/min 離心5 min，棄上清，用PBS 洗滌2 次，最后加入1%多聚甲醛300 μL 固定后上機檢測。

1.3.5 CD4+CD25+Treg 細胞內細胞因子IL-10 和TGF-β 的檢測 具體方法參見文獻[4]：取上述凍存PBMC 培養(yǎng)上清， 采用ELISA 法檢測上清中IL-10和TGF-β 水平，按試劑盒提供的說明書進行操作。

1.4 療效標準

治愈：外陰尖銳濕疣疣體全部脫落，臨床癥狀消失，宮頸HPV-DNA 復查結果為陰性。 顯效：宮頸HPV-DNA 復查結果為陰性或弱陽性，外陰尖銳濕疣疣體脫落70%以上。 無效：HPV-DNA 復查結果為陽性或強陽性，外陰尖銳濕疣疣體無改變或無明顯脫落。總有效率=（治愈例數(shù)+顯效例數(shù)）/總例數(shù)×100%。 以3 個月為治療終點，計算總有效率。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

CA 患者經局部44℃溫熱治療3 個月后，總有效率達85.71%（30/35），治療中未見明顯副作用。

2.1 兩組外周血CD4+CD25+Treg 細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞、抑制性膜分子和細胞因子表達水平的比較

CA 組患者CD4+CD25+Treg 細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞及抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L 表達水平均顯著高于對照組（均P ＜0.05）；CA 組患者IL-10及TGF-β 的陽性細胞數(shù)比對照組明顯增多（均P ＜0.05）。見表1。

表1 兩組外周血CD4+CD25+Treg 細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞、抑制性分子和細胞因子表達水平比較（±s）

表1 兩組外周血CD4+CD25+Treg 細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞、抑制性分子和細胞因子表達水平比較（±s）

注：CA：尖銳濕疣；CTLA-4：細胞毒性T 淋巴細胞抗原4；GITR：腫瘤壞死因子受體；PD-L：程序性死亡分子1 配體；IL-10：白細胞介素-10；TGF-β：轉化生長因子-β

組別 例數(shù) CD4+CD25+Treg 細胞（%） CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞（%） CTLA-4 GITR PD-L IL-10 TGF-β對照組CA 組t 值P 值35 35 10.5±1.8 15.2±2.3 9.52＜0.05 5.8±1.4 13.1±2.5 15.07＜0.05 1.2±0.4 3.2±1.3 8.63＜0.05 8.6±1.6 13.2±2.5 9.16＜0.05 1.4±0.5 2.3±0.9 10.92＜0.05 0.47±0.13 0.60±0.20 3.22＜0.05 0.15±0.06 0.32±0.13 7.02＜0.05

2.2 治療前后CA 患者外周血CD4+CD25+Treg 細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞、抑制性膜分子和細胞因子表達水平比較

治療后外周血CD4+CD25+Treg 細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞、CTLA-4、GITR、PD-L 水平及IL-10、TGF-β 陽性細胞數(shù)較治療前顯著下降（均P ＜0.05）。見表2。

3 討論

大量研究表明，免疫系統(tǒng)在人乳頭瘤病毒引起的相關疾病結局上起重要作用，HPV 持續(xù)感染的重要機制是全身或局部細胞免疫功能缺陷，病損局部主要組織相容性復合體（MHC）Ⅰ和MHCⅡ分子的下調，導致惡性變[1-4]。近年隨著對CD4+CD25+Treg 各種生物學特性和功能的進一步研究，CD4+CD25+Treg 細胞表面表達CD25、CTLA-4、GITR 和PD-L 等膜分子，其特征性的分子標記是Foxp3+，發(fā)現(xiàn)HPV 感染很可能存在Treg 異常，如HPV 病損局部可有CD4+CD25+Foxp3+Treg 高表達，也不具有MHC 限制性，主要通過細胞間直接接觸和分泌抑制性膜分子IL-10 和TGF-β 發(fā)揮免疫抑制功能，免疫抑制環(huán)境主要由局部低表達細胞因子IL-2、IFN-γ 和TGF-β、IL-10 高表達形成。CD4+CD25+Treg 細胞是一種新型免疫抑制調節(jié)細胞，機體對病毒感染的免疫應答主要通過抑制增殖效應細胞和分泌細胞因子來調控，CD4+CD25+Treg 細胞免疫抑制效應可能在CA 的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[5]，提示刺激HPV 發(fā)生特異性免疫反應可通過抑制或去除Treg 細胞來達成，從而抑制HPV 的持續(xù)慢性感染。隨著熱療技術的相關原理研究進一步深入，以及對溫度測定、控制和加熱技術的不斷進步，熱療技術在臨床上得到了廣泛的應用。 近年來，溫熱被廣泛應用于各種病毒疣的治療，并且取得了良好的療效，但其具體的作用機制尚不明了[6-7]。 有研究表明，44℃溫熱能夠促進LC 成熟、遷移，并且增強其抗原提呈能力，LC能通過真皮層向局部淋巴結遷移，誘導病毒疣局部細胞發(fā)生免疫應答，從而對病毒感染引起的病毒疣發(fā)揮有效作用[8-9]。

表2 治療前后CA 患者外周血CD4+CD25+T 細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞、抑制性分子及細胞因子表達水平比較（±s）

表2 治療前后CA 患者外周血CD4+CD25+T 細胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞、抑制性分子及細胞因子表達水平比較（±s）

注：CA：尖銳濕疣；CTLA-4：細胞毒性T 淋巴細胞抗原4；GITR：腫瘤壞死因子受體；PD-L：程序性死亡分子1 配體；IL-10：白細胞介素-10；TGF-β：轉化生長因子-β

時間 例數(shù) CD4+CD25+Treg 細胞（%） CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞（%） CTLA-4 GITR PD-L IL-10 TGF-β治療前治療后t 值P 值35 35 15.2±2.3 11.2±2.0 7.76＜0.05 13.1±2.5 6.5±1.7 12.91＜0.05 3.2±1.3 1.4±0.5 7.46＜0.05 13.2±2.5 9.2±1.8 7.68＜0.05 2.3±0.9 1.6±0.6 9.29＜0.05 0.60±0.20 0.50±0.10 2.64＜0.05 0.32±0.13 0.17±0.07 6.01＜0.05

本研究結果表明，CA 患者CD4+CD25+Treg 細胞、 轉錄因子Foxp3+及抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L 表達均比對照組顯著增高 （P ＜0.05）；CA 組CD4+CD25+T 細胞內分泌IL-10 及TGF-β 的陽性細胞數(shù)比對照組明顯增多， 說明機體免疫功能受到明顯抑制，CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞及相關因子共同參與了尖銳濕疣的發(fā)生發(fā)展，CA 患者高表達CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞數(shù)，可誘導其增殖活化，同時高表達轉導抑制信號的負性協(xié)同刺激分子CTLA-4、GITR 及PD-L， 其表達水平可以反映Treg 細胞功能的強弱，通過某種機制抑制機體免疫功能的影響，這在尖銳濕疣發(fā)病機制中起重要作用[10]。 也有學者指出，Treg 細胞可以通過直接接觸和分泌抑制性因子IL-10及TGF-β 發(fā)揮免疫抑制和感染耐受的雙重作用[11]。尖銳濕疣發(fā)生及持續(xù)感染的重要機制之一在于機體不能產生有效的免疫保護作用[12]，CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞通過抑制CD4+和CD8+細胞的IL-2 基因轉錄和表達來抑制T 細胞的活化增殖， 使局部微環(huán)境處于免疫抑制或耐受狀態(tài)，F(xiàn)oxp3+Treg 細胞通過TGF-β 在促進自身增殖分化同時抑制Th1和Th2分化，從反向抑制了機體局部抗病毒免疫應答[13]，形成尖銳濕疣持續(xù)感染， 促進了尖銳濕疣生長和發(fā)展。有研究表明，CA 患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞含量明顯增高，且復發(fā)患者顯著高于初發(fā)患者，提示尖銳濕疣患者存在有一定程度上病毒特異性細胞免疫受損， 而細胞免疫功能水平直接影響尖銳濕疣HPV 感染的病程及其疾病的轉歸，通過抑制或去除Treg 細胞來刺激HPV 特異性免疫反應，從而抑制HPV慢性感染[14]。 局部44℃溫熱治療3 個月，治愈率達85.71%， 治療中未見明顯副作用， 外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞數(shù)量、CTLA-4、GITR、PD-L、IL-10 和TGF-β 水平顯著下降（P ＜0.05），表明溫熱能夠有效治療HPV 感染尖銳濕疣病，這可能與協(xié)助增強機體免疫功能有關。 溫熱治療疣體的說法不一，有些研究者認為病灶組織與正常組織相比， 對溫熱更敏感[15]，熱損傷后更不易恢復[16]，有些則推測可能是溫熱引起病變組織壞死。 研究發(fā)現(xiàn)，44℃溫熱治療尖銳濕疣病后， 機體可抑制CD4+CD25+Treg 細胞增殖活化，負性調節(jié)刺激分子CTLA-4、GITR、PD-L 以及抑制性細胞因子IL-10、TGF-β，推測其機制可能為促進了局部免疫調節(jié)作用，引起靶疣局部LC 向附近淋巴結遷移和增強抗原提呈功能，從而促成特異性免疫應答的建立， 破除由局部高表達IL-10 和TGF-β 形成的免疫抑制環(huán)境，抑制免疫逃逸機制以清除HPV 病毒[2，17]。

綜上所述，本研究認為，44℃溫熱治療尖銳濕疣具有較好的臨床療效，能有效調節(jié)機體的免疫功能，其治療機制可能與調節(jié)CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞及相關分子有關，值得臨床進一步推廣應用。

[1] 劉慧賢.CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞與HPV 感染的相關性[J].中國麻風皮膚病雜志，2013，29（5）：328-330.

[2] 李曉東，高興華，洪玉曉，等.溫熱對HPV 感染皮膚LC成熟功能的影響[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2010，24（2）：122-124.

[3] 袁少英，倫新，劉東生，等.復發(fā)性生殖器皰疹患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞的檢測[J].中華皮膚科雜志，2006，39（12）：695-698.

[4] 錢起豐，郭紅衛(wèi).復發(fā)性生殖器皰疹患者外周血CD3+T細胞內細胞因子的檢測[J].中華皮膚科雜志，2001，34（3）：195-197.

[5] 許艷靜，郭淑蘭.Foxp3 在尖銳濕疣皮損中的表達及其意義[J].中國麻風皮膚病雜志，2010，26（3）：167-169.

[6] 王彥芳.尖銳濕疣的診斷治療與預防進展[J].中國性科學，2005，14（8）：31-34.

[7] 奚丹，李如覲，趙太娟，等.尖銳濕疣治療的現(xiàn)狀與進展[J].中國性科學，2008，17（5）：25-26，28.

[8] Huo W，Di ZH， Xiao BH，et al. Clearance of genital warts in pregnant women by mild local hyperthermia：a pilot report [J]. Dermatol Ther，2014，27（2）：109-112.

[9] Huo W，Li GH，Qi RQ，et al. Clinical and immunologic results of local hyperthermia at 44℃for extensive genital warts in patients with diabetes mellitus [J]. Int J Hyperthermia，2013，29（1）：17-20.

[10] 錢起豐，盧創(chuàng)林，張明霞.尖銳濕疣患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞的檢測[J].中華皮膚科雜志，2008，41（5）：311-313.

[11] Pandiyan P，Zheng L，Ishihara S，et al. CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4+T cells [J]. Nat Immunol，2007，8（12）：1353-1362.

[12] 李丹，張霞，曾碧冰，等.203 例女性外陰尖銳濕疣患者宮頸HPV 基因型檢測及分析[J].中國性科學，2012，21（3）：26-29.

[13] Miller MM，Akaronu N1，Thompson EM，et al. Modulating DNA methylation in activated CD8+T cells inhibits regulatory T cell-induced binding of Foxp3 to the CD8+T Cell IL-2 promoter[J].J Immunol，2015，94（3）：990-998.

[14] 徐妍，葉俊，朱可建.尖銳濕疣患者外周血Foxp3+CD4+CD25+調節(jié)性T 細胞的檢測及意義[J].中華傳染病雜志，2009，27（8）：484-486.

[15] 曹海鵬，朱楨，喬國煜，等.微波聯(lián)合干擾素外用治療尖銳濕疣295 例療效觀察[J].中國醫(yī)藥，2010，5（4）：365-366.

[16] 馮沂，陳麗霞.不同方法治療女性尖銳濕疣療效分析[J].中外醫(yī)學研究，2013，11（18）：47-48.

[17] 楊康寧.CO2激光聯(lián)合白介素2 治療尖銳濕疣的臨床療效分析[J].中外醫(yī)學研究，2012，10（21）：39-40.