吳 軍，劉 荻，馬 卓

（湖北工業(yè)大學(xué) 輕工學(xué)部，湖北 武漢430068）

雷公藤是一味常用中藥材，具有殺蟲止血、舒筋活血、祛風(fēng)通絡(luò)、清熱解毒、消腫止痛等功效［1］。但根據(jù)國(guó)家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心2004－2011年的報(bào)告顯示，雷公藤制劑在治療疾病的同時(shí)也伴隨著嚴(yán)重的肝毒性、腎毒性、生殖毒性及皮膚毒性［2］，因此，亟需進(jìn)一步研究雷公藤的治病機(jī)制，以便降低其毒副作用。現(xiàn)階段對(duì)雷公藤的研究主要集中在雷公藤紅素的治病機(jī)理上。雷公藤紅素（Celastrol，Cel），是一種三萜類化學(xué)成分［3］（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1），具有抑制免疫反應(yīng)和抗炎的作用［4－5］，但其難溶于水、口服吸收差及毒性較大限制了它的臨床應(yīng)用。醇質(zhì)體具有較高的雙分子層流動(dòng)性、易于變形及可穿透皮膚屏障等優(yōu)點(diǎn)［6］，故本試驗(yàn)以醇質(zhì)體為載體，考察不同促滲劑對(duì)Cel醇質(zhì)體體外透皮吸收的影響，篩選出最佳促滲劑。

圖1 雷公藤紅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器

CAV214C電子天平，奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；U-3000高效液相色譜儀，戴安；TP2A型智能透皮試驗(yàn)儀，鞏義市英峪予華儀器廠（擴(kuò)散池參數(shù):擴(kuò)散面積1.77cm2，接受池容積18mL）；QL-901旋渦混合器，江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；KQ-300TDB型高頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試藥

Cel、Cel對(duì)照品，中科院武漢植物園，批號(hào)20130524；丙二醇、甘油，國(guó)家集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20121019；薄荷腦，南通薄荷廠，批號(hào)20140101；水溶性氮酮，武漢金信達(dá)醫(yī)藥輔料技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)20140702；甲醇，色譜純；乙醇、冰醋酸，均為分析純；吐溫80，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20121225；超純水；磷酸鹽緩沖液，PBS，pH＝7.4，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

昆明種雄性小鼠（SPF級(jí)，體重18～22g），湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào):SCXK（鄂）2008－0005。

2 方法與結(jié)果

2.1 Cel醇質(zhì)體的制備

采用乙醇注入法制備醇質(zhì)體［7］。精密稱取一定量Cel、蛋黃卵磷脂、膽固醇于小燒杯中，加入無(wú)水乙醇，密封，50℃恒溫水浴使其溶解，構(gòu)成有機(jī)相；另取一定量超純水加入平底燒瓶中，置于磁力攪拌器（700r/min）上，構(gòu)成水相。將另取26mL超純水加入平底燒瓶中，置于磁力攪拌器，攪拌速度為700r/min，攪拌溫度50℃，構(gòu)成水相。在密閉條件下用注射器將有機(jī)相緩慢加入到水相中，繼續(xù)攪拌2h，自然冷卻后超聲30min，將所得混懸液用0.45μm孔徑有機(jī)系濾膜過(guò)濾，即得。

2.2 含量測(cè)定方法

2.2.1 色譜條件 Agilgent HC-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫35℃；流動(dòng)相為V（甲醇）∶V（1%冰醋酸）＝90∶10；檢測(cè)波長(zhǎng)425nm；流速為1mL/min；進(jìn)樣量20μm。Cel對(duì)照品、含藥接收液及空白接受液的HPLC色譜圖見(jiàn)圖2，空白接收液成分對(duì)樣品測(cè)定沒(méi)有干擾，表明上述色譜條件可行。

圖2 HPLC色譜圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取Cel對(duì)照品10 mg，置于100mL量瓶中，無(wú)水乙醇定容，得到濃度為100μg/mL的Cel儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備液1、2、4、5、6、8mL分別于10mL量瓶中，無(wú)水乙醇定容，得到濃度為10.0、20.0、40.0、50.0、60.0、80.0、100.0μg/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（A）和質(zhì)量體積（C）分別為縱坐標(biāo)、橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程為A＝0.5054C－0.0479（r＝0.9998），表明 Cel濃度在10.0～100.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖3 雷公藤紅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下10.0、50.0、100.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于1d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；不同天內(nèi)，每日進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣5d，計(jì)算日間精密度。日內(nèi)RSD分別為1.3%、1.1%、0.6%，日間 RSD 分別為 2.3%、1.6%、0.9%，結(jié)果日內(nèi)及日間精密度的RSD均在《中華人民共和國(guó)藥典》（2010版）二部附錄Ⅺ ⅩA的要求范圍內(nèi)，說(shuō)明日內(nèi)及日間精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性考察 精密吸取1mL雷公藤紅素醇質(zhì)體液，置于10mL容量瓶，甲醇定容，超聲15 min破乳，分別于0、2、4、6、8、12、24h進(jìn)行測(cè)樣，計(jì)算RSD。結(jié)果RSD為1.1%，表明Cel標(biāo)準(zhǔn)溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 體外透皮試驗(yàn)

2.3.1 離體小鼠皮膚的制備 取18～22g的健康昆明小鼠，用脫毛劑（8%硫化鈉漿糊:硫化鈉8g，淀粉7g，糖4g，甘油5g，硼砂1g，加水75mL攪拌均勻）脫去小鼠腹部毛發(fā)，邊脫邊洗，放置過(guò)夜，第二天短頸處死小鼠，剝?nèi)∑つw，除去皮下組織和脂肪，生理鹽水漂洗干凈后即用。

2.3.2 透皮吸收實(shí)驗(yàn)［8］將離體小鼠皮膚固定在給藥池與接受池之間，接受液液面與皮膚真皮層面接觸；給藥池分別注入Cel醇質(zhì)體、空白醇質(zhì)體/Cel溶液和Cel溶液2mL，接受池中分別加入18mL透皮接受液（20%乙醇，0.5%聚山梨酯-80的 PBS液），液體恒速攪拌（400r/min），并保持恒溫37℃（±0.1℃），分別于2，4，6，8，10，12，24，48h取1 mL接受液，及時(shí)用移液槍補(bǔ)充同溫同體積的新鮮接受液。將取得的樣品用0.22μm的有機(jī)微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣檢測(cè)，累積滲透量和滲透速率計(jì)算公式

滲透速率

式中:Cn為不同取樣點(diǎn)時(shí)的接受液的濃度；Ci為各取樣點(diǎn)時(shí)取樣液的濃度；V，Vi分別為接受池體積和取樣體積；A 為透皮擴(kuò)散面積（1.77cm2）；Δt為取樣點(diǎn)的時(shí)間間隔。

2.3.3 接收液的選擇 選擇透皮接受液的原則是使藥物被機(jī)體吸收的環(huán)境達(dá)到“漏槽條件”，即藥物在接受液中的累積滲透量要較大。實(shí)驗(yàn)中分別配制生理鹽水，V（乙醇）∶V（PEG400）∶V（生理鹽水）＝5∶2∶3，V（乙醇）∶V（TW80）∶V（PBS）＝20∶0.5∶80）及V （乙醇）∶V （PBS）＝20∶80）這四種接受液，分別測(cè)定48h時(shí)Cel醇質(zhì)體在這4種接收液中的累積滲透量。其透皮結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，Cel醇質(zhì)體在乙醇/TW80/PBS中的累積滲透量最大，為77.01μg/cm2，故選擇乙醇/TW80/PBS為接受液。分別如下:

累積滲透量

表1 不同接收液中48 h后Cel醇質(zhì)體的累積滲透量與累積透過(guò)率（n＝3）

2.3.4 不同促滲劑對(duì)Cel醇質(zhì)體透皮吸收的影響

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的查閱和前期考察，本實(shí)驗(yàn)選擇了幾種常用的促滲劑:丙二醇、甘油、氮酮及薄荷腦，同時(shí)考慮到促滲劑的刺激性問(wèn)題，將丙二醇、甘油、氮酮及薄荷腦的考察范圍分別設(shè)定為5%～15%、1%～5%、1%～3%及0.5%～1.5%，按“2.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察不同促滲劑對(duì)Cel醇質(zhì)體體外透皮吸收的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明不同的促滲劑對(duì)Cel醇質(zhì)體透皮吸收有不同的影響:當(dāng)加入薄荷腦和甘油后，Cel醇質(zhì)體的滲透速率減小了；而丙二醇和氮酮能促進(jìn)Cel醇質(zhì)體的透皮吸收，其中，丙二醇的促滲效果最明顯，且滲透速率隨著丙二醇含量的增加而增加，當(dāng)丙二醇的含量為15%時(shí)，促滲作用最大，增滲倍數(shù)為1.26倍。

表2 不同促滲劑對(duì)Cel醇質(zhì)體體外透皮吸收的影響（n＝3）

3 討論與結(jié)論

將Cel制備成醇質(zhì)體，以便將來(lái)可能作為搽劑來(lái)治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，其中累積透過(guò)量和滲透速率是判斷一種藥物是否能達(dá)到療效的重要指標(biāo)。根據(jù)透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，薄荷腦和甘油不利于Cel醇質(zhì)體的透皮吸收，可能是由于薄荷腦和甘油的加入導(dǎo)致了醇質(zhì)體雙分子層結(jié)構(gòu)的破壞，引起了藥物滲漏。丙二醇的作用機(jī)制主要是通過(guò)在角質(zhì)層蓄積，增加藥物在角質(zhì)層中的溶解性和分配性，從而起到促滲作用。因此可考慮丙二醇作為Cel醇質(zhì)體的促滲劑。

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