羅婭君， 邊清泉， 羅 英， 閔昌松

（綿陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，四川綿陽(yáng)621000）

大孔樹(shù)脂吸附馬比木中喜樹(shù)堿的工藝

羅婭君， 邊清泉， 羅 英， 閔昌松

（綿陽(yáng)師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，四川綿陽(yáng)621000）

目的研究大孔吸附樹(shù)脂吸附馬比木中喜樹(shù)堿的純化工藝條件及吸附參數(shù)。方法利用高效液相色譜 （HPLC）法測(cè)量馬比木中喜樹(shù)堿的含有量，以喜樹(shù)堿吸附率和解析率為指標(biāo)，通過(guò)靜態(tài)飽和吸附與解吸試驗(yàn)對(duì)3種型號(hào)樹(shù)脂進(jìn)行篩選，再通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)對(duì)吸附工藝參數(shù)進(jìn)行全面優(yōu)化。結(jié)果AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)馬比木中喜樹(shù)堿的吸附與解析性能較好 （靜態(tài)吸附率為93.97%，解析率為75.00%）。最佳吸附條件為：喜樹(shù)堿檢測(cè)波長(zhǎng)為253 nm，樣品液中喜樹(shù)堿的質(zhì)量濃度為0.087 mg/mL，含有量為7.25 mg/g。樣品液體積流量為0.5 mL/min，樣品液pH8，洗脫劑為80%乙醇，馬比木喜樹(shù)堿解析率為86.34%。結(jié)論AB-8型大孔吸附樹(shù)脂可有效吸附馬比木中喜樹(shù)堿，為馬比木資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)，建立良好的理論基礎(chǔ)。

馬比木；喜樹(shù)堿；大孔吸附樹(shù)脂；高效液相色譜

馬比木Nothapodytes Pittosporoides（O1iv.）s1eum系茶茱萸科植物海桐假柴龍樹(shù)，又名海桐馬比木、海桐假柴龍樹(shù)、追風(fēng)傘、公黃珠子等。馬比木全草入藥，是一種重要的藥用植物，其功能表現(xiàn)為活血止痛、祛風(fēng)通絡(luò)，主治小兒驚風(fēng)、半身不遂、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷以及浮腫等［1］，為多年生草本，分布于湖北、湖南、四川及貴州等地［2］。它的根部主要含喜樹(shù)堿及其甲基衍生物，在臨床上被用于消化系統(tǒng)惡性腫瘤的治療［3-4］。隨著市場(chǎng)對(duì)喜樹(shù)堿及其衍生物的需求量的增長(zhǎng)和國(guó)家對(duì)喜樹(shù)植株的重點(diǎn)保護(hù)，馬比木作為喜樹(shù)堿新藥源的替代品，已越來(lái)越受到研究者青睞。據(jù)報(bào)道，馬比木根中喜樹(shù)堿的含有量高于喜樹(shù)果中喜樹(shù)堿的含有量［5-8］，其根莖中所含喜樹(shù)堿的含有量最高可達(dá)0.392%，而喜樹(shù)果中喜樹(shù)堿的含有量較低，四川地區(qū)最高含有量為0.118%，福建地區(qū)最高含有量為0.190%［9］。

大孔吸附樹(shù)脂分離技術(shù)是繼離子交換樹(shù)脂后發(fā)展起來(lái)的一種新型分離新技術(shù)，克服了離子交換樹(shù)脂易污染、耗酸量大等缺點(diǎn)。近年，它在中藥復(fù)方的制備、中藥制劑的生產(chǎn)以及中草藥有效成分的提取分離方面日益受到重視［10-12］。目前，未見(jiàn)有關(guān)大孔吸附樹(shù)脂吸附馬比木中喜樹(shù)堿的工藝研究，為了合理利用自然資源和保護(hù)自然資源，同時(shí)提高喜樹(shù)堿的產(chǎn)量，本實(shí)驗(yàn)選用3種不同型號(hào)的大孔吸附樹(shù)脂，分別探索了它們對(duì)馬比木中喜樹(shù)堿的吸附和解析效果，找到吸附率與解析率最佳的大孔樹(shù)脂，并對(duì)該大孔樹(shù)脂做動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，確定其最佳的工藝條件，為馬比木資源的綜合開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)的依據(jù)，并建立良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

SHZ-8水浴恒溫振蕩器 （上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；AUY120電子天平 （日本島津公司）；As-10200T超聲波清洗器 （天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；島津高效液相色譜系統(tǒng)，包括LC-20A T輸液泵，SPD-10AUP二極管陣列檢測(cè)器，CLASS-vp5.0色譜數(shù)處理工作站，CTD-6A色譜柱溫箱 （日本島津公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）；FW-177中草藥高速粉碎機(jī) （天津市泰斯特儀器由有限公司）。

喜樹(shù)堿對(duì)照品 （上海永恒生物科技有限公司，經(jīng)高效液相分析純度為99.6%）；馬比木根 （采自貴州），經(jīng)鑒定為茶茱萸科植物海桐假柴龍樹(shù)Nothapodytes Pittosporoides（O1iv.）s1eum.的根；D101型大孔吸附樹(shù)脂（成都市科龍化工試劑廠）；AB-8型大孔吸附樹(shù)脂、S-8型大孔吸附樹(shù)脂（安徽三星樹(shù)脂科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 喜樹(shù)堿的測(cè)定

2.1.1 喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 取喜樹(shù)堿對(duì)照品2.6 mg，精密稱(chēng)定，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解，定容并搖勻，得104μg/m L喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，放于冰箱中冷藏。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 精密吸取10μL的喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)得其紫外分光光譜圖。由光譜圖可知，喜樹(shù)堿分別在218 nm、254 nm和360 nm三處有強(qiáng)吸收，但是在218 nm波長(zhǎng)處存在不明組分的吸收，將會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，在360 nm波長(zhǎng)處，其吸收強(qiáng)度不如在254 nm波長(zhǎng)處強(qiáng)。所以選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2.1.3 色譜條件［13］色譜柱為Diamonsi1TMC18（5μm，4.6 mm×250mm），流動(dòng)相為甲醇-水 （5.5∶4.5），體積流量0.9mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10μL。分離度大于1.5；靈敏度為0.050AUFS；理論板數(shù)按喜樹(shù)堿計(jì)算均大于4500。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制［13］分別精密吸取 “2.1.1”項(xiàng)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液1、3、5、7、9μL，按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量 （μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積均值 （μv.s）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y=1.619 9×106X-19 573.3（r=0.999 9），結(jié)果表明喜樹(shù)堿在0.2～1.8μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.5 樣品液的配制 馬比木根自然曬干粉碎，過(guò)60目篩得馬比木粉末。取100 mL錐形瓶，加入準(zhǔn)確稱(chēng)取的3.0 g樣品，再加入80 mL的甲醇在25℃條件下超聲提取，每次超聲30min，超聲2次，將兩次的提取液減壓過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)入250mL量瓶中，用甲醇定容，并放于冰箱中冷藏。

精密吸取提取液10μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣2次，用外標(biāo)法計(jì)算樣品溶液中喜樹(shù)堿的質(zhì)量濃度，取平均值。250 mL樣品液中喜樹(shù)堿的質(zhì)量濃度為0.087 mg/m L，喜樹(shù)堿的含有量為7.25 mg/g。對(duì)照品和馬比木粗提物的HPLC色譜圖分別見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 對(duì)照品喜樹(shù)堿的HPLC色譜圖

圖2 馬比木粗提物HPLC色譜圖

2.2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附和解吸

2.2.1 大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理 分別稱(chēng)取D101、AB-8、S-8型大孔吸附樹(shù)脂各2.0 g，根據(jù)文獻(xiàn)和3種樹(shù)脂的性質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理［14-16］。

D101：先用無(wú)水乙醇浸泡24 h，濕法裝柱，再用95%乙醇淋洗樹(shù)脂柱至流出液加水不混濁，然后用蒸餾水淋洗至無(wú)醇味，用蒸餾水浸泡待用。

AB-8：濕法裝柱，95%乙醇洗至流出液加水不渾濁，用蒸餾水淋洗樹(shù)脂柱至流出液無(wú)醇味，再用4%NaOH溶液2-3床體積淋洗樹(shù)脂，然后用蒸餾水淋洗樹(shù)脂柱至流出液為中性，用蒸餾水浸泡待用。

S-8：無(wú)水乙醇浸泡3～4 h，濕法裝柱，用95%乙醇淋洗樹(shù)脂柱至流出液不渾濁，再用蒸餾水淋洗樹(shù)脂柱至流出液無(wú)醇味，蒸餾水浸泡待用。

2.2.2 樹(shù)脂的再生 樹(shù)脂柱用蒸餾水淋洗至流出液無(wú)醇味，控制體積流量1～2 BV/h（BV表示床體積的倍數(shù)，即所用淋洗液的體積等于床體積的倍數(shù)），用3%HC1溶液淋洗樹(shù)脂柱2～4 h，再用蒸餾水淋洗至流出液呈中性，控制體積流量1～2 BV/h，然后用5%NaOH溶液洗樹(shù)脂柱2～4 h，最后用蒸餾水淋洗至流出液呈中性，蒸餾水浸泡樹(shù)脂，即可繼續(xù)使用。

2.2.3 靜態(tài)吸附和解吸 準(zhǔn)確移取10mL馬比木提取液于100 mL帶塞的錐形瓶中，平行移取3份，分別加入通過(guò)預(yù)先處理好的D101、AB-8、S-8型大孔吸附樹(shù)脂各2.0 g，置于20℃，搖速恒定的水浴恒溫?fù)u床中吸附24 h，抽濾得濾液 （抽濾后的樹(shù)脂用于靜態(tài)解析），取濾液1 mL于比色管中，用甲醇稀釋至10 mL，HPLC測(cè)定吸附液的濃度，用下式計(jì)算吸附量和吸附率。

吸附量=（C0-C1）

吸附率=（C0V0-C1VI）/C0V0×100%

式中，C0為吸附前溶液中喜樹(shù)堿的質(zhì)量濃度，μg/mL；C1為吸附后溶液中喜樹(shù)堿的質(zhì)量濃度，μg/mL；V0為吸附前溶液的體積，mL；V1為吸附后溶液的體積，mL。

取靜態(tài)吸附抽濾后的樹(shù)脂分別加入到100 mL具塞的3個(gè)錐形瓶中，再分別加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇，置于20℃，搖速恒定的水浴恒溫?fù)u床中解析24 h，抽濾得到濾液，取濾液1 mL于比色管中，HPLC測(cè)定解析液質(zhì)量濃度，用下式計(jì)算解析率。

解析率=C2V2/（C0V0-C1V1）×100%

式中，C0、C1、V0、V1同上，C2為解析液中喜樹(shù)堿的質(zhì)量濃度 （μg/mL）；V2：解析液的體積 （m L）。3種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)喜樹(shù)堿的靜態(tài)飽和吸附率和解析率如表1。

表1 3種大孔樹(shù)脂對(duì)喜樹(shù)堿的靜態(tài)吸附和解吸情況

在考察大孔樹(shù)脂對(duì)喜樹(shù)堿的靜態(tài)吸附與解析效果時(shí)，主要考慮其極性、比表面積、孔徑不同以及喜樹(shù)堿的分子體積等因素。這些因數(shù)的共同作用使得大孔樹(shù)脂對(duì)喜樹(shù)堿的吸附能力的強(qiáng)弱不同，解吸程度也存在著差別。為了保證最大程度地提取天然藥物中的有效成分，對(duì)大孔吸附樹(shù)脂的要求不僅要達(dá)到吸附率高，而且還要滿(mǎn)足解吸率高。表1表明，D101、AB-8型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)喜樹(shù)堿的吸附率都較大。D101的吸附率最大，但解析率較低，綜合考慮吸附量與解析率，AB-8樹(shù)脂性能最佳，故優(yōu)選AB-8樹(shù)脂來(lái)進(jìn)一步研究其對(duì)喜樹(shù)堿的富集純化工藝。

2.3 AB-8動(dòng)態(tài)吸附和解吸

2.3.1 上樣液體積流量對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附率的影響 取樹(shù)脂柱，濕法裝入已經(jīng)預(yù)處理過(guò)的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂2.0 g，準(zhǔn)確移取上樣液10 mL上柱，調(diào)節(jié)體積流量分別為0.5、1、2、2.5、3.5mL/min進(jìn)行吸附，用潔凈干燥的錐形瓶接收流出液。分別取1mL流出液于比色管中，用甲醇稀釋至10 mL，HPLC法測(cè)定吸附液的濃度，不同體積流量下樹(shù)脂的吸附率見(jiàn)圖3。

圖3 不同體積流量對(duì)吸附率的影響圖 （n=3）

在生產(chǎn)工藝中考慮到生產(chǎn)成本，一般控制體積流量在0.5～5 mL/min。由圖3可知，樣品液的體積流量越小，大孔樹(shù)脂的吸附率越大，但是體積流量過(guò)小，消耗的時(shí)間越長(zhǎng)。綜合考慮吸附率與吸附時(shí)間，當(dāng)上樣液體積流量為0.5mL/min時(shí)，大孔樹(shù)脂對(duì)喜樹(shù)堿的吸附率達(dá)到94.62%，同時(shí)吸附時(shí)間也較合適。所以，選擇控制上樣液為體積流量0.5 m L/m in。

2.3.2 上樣液pH對(duì)大孔吸附樹(shù)脂吸附率的影響 取樹(shù)脂柱，濕法裝入已經(jīng)預(yù)處理過(guò)的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂2.0 g，準(zhǔn)確移取4份上樣液各10mL，2份用5%HC1溶液調(diào)pH為3、5，2份用4%NaOH溶液調(diào)pH為8、10，控制體積流量0.5 mL/min對(duì)其吸附，用潔凈干燥的錐形瓶接收流出液。分別取1 mL流出液于比色管中，用甲醇稀釋至10 mL，HPLC法測(cè)定吸附液的濃度，不同pH下樹(shù)脂的吸附率見(jiàn)圖4。

圖4表明，隨著上樣液pH的增加，吸附率逐漸增大。喜樹(shù)堿在堿性條件下會(huì)生成相應(yīng)的羧酸鹽，增加了大孔樹(shù)脂對(duì)它的吸附量，但是考慮到喜樹(shù)堿鈉鹽的不穩(wěn)定性。所以，選擇調(diào)節(jié)上樣液的pH=8。

圖4 上樣液pH對(duì)吸附率的影響圖（n=3）

2.3.3 洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解析率的影響 樹(shù)脂柱濕法裝入已經(jīng)預(yù)處理過(guò)的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂2.0 g，準(zhǔn)確移取上樣液10 mL，調(diào)節(jié)pH=8和控制體積流量為0.5 m L/m in對(duì)其吸附。用20 mL體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、95%的乙醇洗脫樹(shù)脂柱，用潔凈干燥的錐形瓶接收洗脫液。各取1 mL洗脫液于比色管中，用甲醇稀釋至10 m L，HPLC法測(cè)定解析液的濃度，不同體積分?jǐn)?shù)下乙醇對(duì)喜樹(shù)堿的解析率見(jiàn)圖5。

圖5 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)喜樹(shù)堿的洗脫效果圖 （n=3）

從圖5可以看出，隨著乙醇的體積分?jǐn)?shù)增加，對(duì)喜樹(shù)堿的解析率也不斷增大。當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，喜樹(shù)堿的解析率最高為86.34%，所以選擇80%的乙醇作為洗脫劑。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 取3根樹(shù)脂柱，AB-8樹(shù)脂濕法裝柱，pH為8的上樣液10mL上柱，控制體積流量為0.5mL/min對(duì)其吸附。80%的乙醇洗脫樹(shù)脂柱，用潔凈干燥的錐形瓶接收洗脫液。HPLC測(cè)得3次實(shí)驗(yàn)的喜樹(shù)堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為46.9%、45.9%、46.4%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.4%，說(shuō)明該工藝對(duì)喜樹(shù)堿有較好的富集純化作用。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用靜態(tài)與動(dòng)態(tài)吸附法篩選出了適合馬比木中喜樹(shù)堿分離的大孔樹(shù)脂，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AB-8型大孔樹(shù)脂是一種比較理想的樹(shù)脂，對(duì)喜樹(shù)堿的吸附量大，解析率高，適合喜樹(shù)堿的分離純化。當(dāng)10 mL上樣液的體積流量為0.5 mL/min、pH 8、20mL 80%乙醇作為洗脫劑時(shí)，純化后喜樹(shù)堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.4%。大孔樹(shù)脂法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化后喜樹(shù)堿高度富集，雜質(zhì)減少，該工藝能為馬比木的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，促進(jìn)喜樹(shù)堿抗癌藥物的開(kāi)發(fā)和研究，有利于自然資源的充分利用和可持續(xù)發(fā)展。

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R284.2

B

1001-1528（2015）08-1859-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.053

2014-03-14

四川省教育廳自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目 （12ZA079）；綿陽(yáng)市科技局重點(diǎn)資助項(xiàng)目 （13G002-2）

羅婭君（1973—），女，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)。E-mai1：1uo1aowu@126.com