濮燕屏， 程惠娟， 段強(qiáng)軍， 黃衛(wèi)鋒

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230038）

魚腥草素鈉聯(lián)合阿奇霉素對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜早期黏附的影響

濮燕屏， 程惠娟*， 段強(qiáng)軍， 黃衛(wèi)鋒

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥230038）

目的研究魚腥草素鈉（sodium houttuyfonate，SH）聯(lián)合阿奇霉素（azithromycin，AZM）對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜早期黏附的影響。方法微量倍比稀釋法測定魚腥草素鈉和阿奇霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度 （minimum inhibitory concentration，MIC）；連續(xù)稀釋法行活菌計(jì)數(shù)，測定1 MIC魚腥草素鈉、1 MIC阿奇霉素單藥組和1/2 MIC魚腥草素鈉+1/2MIC阿奇霉素聯(lián)合組對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜黏附的影響；結(jié)晶紫染色法評(píng)價(jià)不同濃度魚腥草素鈉和阿奇霉素單用及聯(lián)合組對(duì)金黃色葡萄球菌早期生物被膜生長量的影響；掃描電鏡 （SEM）觀察各藥物組對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜形態(tài)的影響。結(jié)果魚腥草素鈉和阿奇霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC分別為64、0.25 mg/L。魚腥草素鈉聯(lián)合阿奇霉素聯(lián)合用藥組能增強(qiáng)阿奇霉素對(duì)生物被膜早期黏附的清除作用，尤以2MIC藥物濃度聯(lián)合組作用最強(qiáng) （與陰性對(duì)照組比較P＜0.001）。電鏡下觀察細(xì)菌數(shù)及形態(tài)也驗(yàn)證了上述結(jié)果。結(jié)論魚腥草素鈉、阿奇霉素可減少金黃色葡萄球菌的早期黏附，抑制生物被膜的形成，聯(lián)合用藥后對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制具有協(xié)同作用，預(yù)期兩藥聯(lián)合使用可以提高生物被膜相關(guān)感染的臨床療效。

金黃色葡萄球菌；生物被膜；魚腥草素鈉；阿奇霉素；黏附作用

分布廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種人獸共患的重要致病菌，常引起皮膚黏膜及多種組織器官的化膿性炎癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有20%～25%人群是金黃色葡萄球菌的長期宿主，75%～80%人群是間歇性宿主［1-2］。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，金黃色葡萄球菌可黏附于導(dǎo)尿管、人工心臟瓣膜等植入性醫(yī)療器材表面形成生物被膜 （biofi1m，BF）［3-5］，而由細(xì)菌產(chǎn)生多聚復(fù)合物基質(zhì)包繞自身形成的生物被膜可大大降低其對(duì)抗生素及消毒劑的敏感性，從而增強(qiáng)它的生存能力［6］。臨床上單一抗生素對(duì)于金黃色葡萄球菌生物被膜的治療效果欠佳，而兩種抗生素聯(lián)用易誘導(dǎo)耐藥性，鑒于此，以生物被膜為對(duì)象，進(jìn)行定向藥物研發(fā)已經(jīng)成為解決金黃色葡萄球菌耐藥性及其生物被膜相關(guān)感染的熱點(diǎn)，但有關(guān)中藥及其有效成分對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜的形成與影響的研究鮮有報(bào)道。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，中藥有效單體魚腥草素鈉（sodium houttuyfonate，SH）能顯著抑制生物被膜形成，并對(duì)抗生素破壞生物被膜形成有較好的增敏和協(xié)同作用［7-8］。本研究旨在通過觀察魚腥草素鈉聯(lián)合阿奇霉素（azithromycin，AZM）對(duì)金黃色葡萄球菌早期生物被膜的作用，以期為中藥治療金黃色葡萄球菌生物被膜相關(guān)感染提供依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株與藥物 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923（中國食品藥品檢定研究院）；魚腥草素鈉對(duì)照品 （中國食品藥品檢定研究院，100247-199601）；陽性對(duì)照藥阿奇霉素（輝瑞制藥有限公司，批號(hào)J20090135）。

1.2 試劑和儀器 LB培養(yǎng)基、胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基 （北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；結(jié)晶紫 （天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純）；DPH-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；紫外分光光度計(jì)；SpectraMax M2e多功能酶標(biāo)儀 （美谷分子儀器上海有限公司）；Sirion200型場掃描電鏡 （美國FEI公司）。

2 方法

2.1 魚腥草素鈉及阿奇霉素對(duì)金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定 按照文獻(xiàn)方法并改進(jìn)［9］，魚腥草素鈉和阿奇霉素分別用 MH（B）培養(yǎng)基稀釋成11個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/L和32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/L。向各96孔平底微量培養(yǎng)板中加入0.5 Mc菌液100μL。另設(shè)1個(gè)不含藥培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，37℃孵育24 h后觀察結(jié)果，以無菌生長的最大稀釋濃度為MIC，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.2 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌黏附作用的影響 分別設(shè)魚腥草素鈉、阿奇霉素單藥組，聯(lián)合用藥組，陰性對(duì)照組。取6孔無菌培養(yǎng)板，每孔加入1片無菌醫(yī)用濾膜和2 mL TSB培養(yǎng)基和200μL的1×104CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌體混懸液，各組加入相應(yīng)濃度的藥物。魚腥草素鈉、阿奇霉素單藥組藥物濃度為1MIC，聯(lián)合用藥組使用濃度為1/2MIC魚腥草素鈉+1/2MIC阿奇霉素，陰性對(duì)照組加入不含藥物培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)6、8、12、24 h后取出濾膜，用無菌PBS清洗浮游菌，將濾膜置于無菌試管中加入5 mL生理鹽水，超聲中震蕩 （超聲頻率40 kHz）20 min，連續(xù)稀釋法傾注培養(yǎng)計(jì)算活菌數(shù)，觀察各藥物在不同時(shí)間段對(duì)細(xì)菌黏附清除后的活菌量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌早期生物被膜生長量的影響

按文獻(xiàn)方法［10］將實(shí)驗(yàn)分成魚腥草素鈉、阿奇霉素 2、1、1/2、1/4、1/8、1/16和1/32 MIC藥物濃度單藥組，及1/2 MIC魚腥草素鈉分別與阿奇霉素2、1、1/2、1/4、1/8、1/ 16和1/32 MIC藥物濃度聯(lián)合組，另設(shè)不含藥物空白組為陰性對(duì)照 （n=4）。96孔板中，每孔中加入調(diào)整好的金黃色葡萄球菌懸液200μL，37℃靜置孵育6、8、12、24 h PBS清洗浮游菌，自然晾干后以0.1%結(jié)晶紫染色20 min，吸棄結(jié)晶紫，PBS清洗，30%冰乙酸脫色，靜置15 min后用紫外分光光度計(jì)測定492 nm處吸光度A。以陰性組A為100%生物被膜，換算各藥物組生物被膜生長量計(jì)算抑制百分率。

2.4 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌黏附作用的形態(tài)學(xué)觀察 將無菌玻片置于6孔板中，分別加入2mL含菌TSB培養(yǎng)基，試驗(yàn)分別以1MIC魚腥草素鈉、1MIC阿奇霉素為給藥濃度，1/2 MIC魚腥草素鈉+1/2 MIC阿奇霉素為聯(lián)合給藥濃度，于37℃靜置培養(yǎng)12 h，用鍍銀染法染色后掃描電鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)的變化以判斷各種藥物的作用效果［11］。

2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本方差分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC測定 魚腥草素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為64 mg/L，阿奇霉素對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.25mg/L。

3.2 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌黏附作用的影響 圖1所示，1 MIC魚腥草素鈉、1 MIC阿奇霉素和1/2 MIC魚腥草素鈉+1/2MIC阿奇霉素藥物濃度分別作用6、8、12、24 h。陰性對(duì)照組無藥物處理。結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組相對(duì)于單藥組清除金黃色葡萄球菌黏附作用明顯增加。

圖1 阿奇霉素單藥組及聯(lián)合組對(duì)金黃色葡萄球菌黏附的影響

3.3 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌早期生物被膜生長量的影響

本研究選用了6、8、12、24 h共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為不同藥物濃度對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜抑制作用的觀察，圖2提示隨著藥物濃度的增加，不同時(shí)間段魚腥草素鈉單藥組對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長均有抑制作用，其中以2× MIC抑制作用最強(qiáng)，與陰性對(duì)照組比較P＜0.001。6 h時(shí)抑制率為68.75%，8 h時(shí)為85.33%，12 h時(shí)為68.75%，24 h時(shí)為58.82%。

圖2 魚腥草素鈉單藥組對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長量的影響 （，n=4）

圖3提示阿奇霉素各單藥組及各藥物濃度聯(lián)合組在不同時(shí)間段對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長均有抑制作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加陰性對(duì)照組的生物膜量逐漸增加，用藥組的生物膜量增加緩慢，且魚腥草素鈉與阿奇霉素聯(lián)合使用時(shí)似乎更能清除生物膜量。例如用藥6 h時(shí)，最低濃度1/32 MIC聯(lián)合組從單藥組抑制率30.38%增加到57.14%，最高濃度2 MIC聯(lián)合組從單藥組抑制率57.14%增加到70.24%，抑制作用的增強(qiáng)呈藥物劑量依賴性。

3.4 藥物對(duì)金黃色葡萄球菌黏附作用的形態(tài)學(xué)觀察 掃描電鏡下觀察到藥物對(duì)細(xì)菌的黏附清除作用明顯，對(duì)照組中能夠看到大量菌體存在和一些菌體分泌物清晰可見，然而藥物作用組中，細(xì)菌的黏附能力受到不同程度的減弱，并且無分泌物的存在，與對(duì)照組對(duì)比鮮明，聯(lián)合用藥組對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑制作用最為明顯。見圖4。

4 討論

細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一是生物被膜的形成。生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境利于生存的一種群居生活現(xiàn)象，包括有細(xì)菌的黏附、發(fā)展、成熟和播散等階段［12］。生物被膜的結(jié)構(gòu)特異性使得細(xì)菌能夠阻礙或延緩抗生素的通透，從而提高自身的耐藥性及免疫逃避性。有研究表明生物被膜細(xì)菌對(duì)抗生素的抵抗力是浮游細(xì)菌的十倍乃至上千倍［13］。傳統(tǒng)抗生素對(duì)細(xì)菌生物被膜引起的慢性和反復(fù)性感染效果欠佳，因此，臨床上細(xì)菌生物被膜感染常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作及愈后差等特點(diǎn)。如何治療由細(xì)菌生物被膜引起的難治性感染已成為臨床相當(dāng)棘手的問題。細(xì)菌形成生物被膜的機(jī)制雖然相當(dāng)復(fù)雜，但黏附于器官及介質(zhì)表面是引起感染的第一步。不能牢固定植于宿主器官或組織表面的細(xì)菌，容易被血液及其他體液沖刷因而不能形成感染，故是否能抑制生物被膜黏附是評(píng)判一個(gè)藥物治療細(xì)菌感染的重要指標(biāo)之一［14］。

圖3 阿奇霉素單藥組及聯(lián)合組對(duì)金黃色葡萄球菌生物被膜生長量的影響 （，n=4）

圖4 掃描電鏡觀察藥物12 h對(duì)金黃色葡萄球菌黏附的影響

目前國內(nèi)外抗生物被膜的研究局限于抗菌西藥的單獨(dú)使用和抗菌藥與抗菌藥或非抗菌藥的聯(lián)合使用，但鮮見有中藥與抗生素聯(lián)用抗生物被膜的研究。中藥魚腥草性味辛、寒，具有清熱解毒、消腫排毒、健脾、利尿通淋等功效，其主要活性成分魚腥草素鈉生物活性高、毒性低［15］。而臨床常見的阿奇霉素對(duì)金黃色葡萄球菌懸浮菌和生物被膜具有較好的抗菌活性［16］。因此，本實(shí)驗(yàn)選用阿奇霉素作為陽性對(duì)照藥，設(shè)計(jì)了6、8、12、24 h 4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，觀察魚腥草素鈉單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥對(duì)金黃色葡萄球菌早期生物被膜的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明一定濃度的魚腥草素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌早期生物被膜具有抑制作用，能減少生物被膜的早期黏附，且隨著藥物濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，尤以2 MIC聯(lián)合用藥組抑制作用最強(qiáng)，活菌計(jì)數(shù)較陰性對(duì)照組及阿奇霉素組均明顯減少，由此推測魚腥草素鈉具有增強(qiáng)阿奇霉素對(duì)生物被膜的滲透及殺菌作用。

抗菌藥的長期使用易產(chǎn)生耐藥性，中藥體外實(shí)驗(yàn)抗菌作用雖弱于抗生素，但卻有著不易耐藥、副作用小、效果持久等優(yōu)勢，近年來有研究表明清熱解毒的中藥也有抗生物被膜的作用［17-18］。由于生物被膜的形成過程涉及環(huán)節(jié)多，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，兩種藥物的聯(lián)合可能是作用于同一靶點(diǎn)或不同靶點(diǎn)，但其具體的機(jī)制尚不明確。因此，在今后除了嘗試中西用藥結(jié)合，發(fā)揮優(yōu)勢互補(bǔ)之外，對(duì)其聯(lián)合用藥過程中對(duì)生物被膜的具體作用機(jī)制亟待于深入研究。

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R966

B

1001-1528（2015）08-1813-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.040

2014-12-29

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81173629）

濮燕屏 （1983—）女，講師，主要從事中藥抗感染與免疫研究。Te1：（0551）65169163，E-mai1：65980935@qq.com

*通信作者：程惠娟 （1953—），女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥抗感染與免疫研究。Te1：（0551）5169204，E-mai1：chenghuijuan53@sina.com