王琳琳， 吳宿慧， 李寒冰， 馬旭陽， 吳金婷

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450008）

基于顏色與抗氧化性評價(jià)金銀花

王琳琳， 吳宿慧， 李寒冰*， 馬旭陽， 吳金婷

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450008）

目的對金銀花外觀顏色與內(nèi)在品質(zhì)進(jìn)行定量表征，建立其品質(zhì)評價(jià)方法。方法16批金銀花分別粉碎后過篩，以三基色原理建立粉末顏色映射值。再采用體外清除DPPH*過氧自由基測定方法檢測對應(yīng)樣品的抗氧化活性，對兩組結(jié)果進(jìn)行聚類分析和皮爾遜相關(guān)分析。結(jié)果金銀花顏色辨識系統(tǒng)性能穩(wěn)定，對同一批金銀花粉末的顏色映射值RSD為4.19% （n=5）。金銀花體外清除DPPH*活性的IC50值與顏色評分聚類結(jié)果呈現(xiàn)較好的負(fù)相關(guān)性，y=-0.014 9x+0.911 5，r=-0.997，（P＜0.001），說明顏色評分IC50越大，抗氧化活性越弱。結(jié)論所建立的中藥顏色辨識系統(tǒng)可以 “以色論質(zhì)”評價(jià)金銀花的品質(zhì)。

金銀花；顏色；映射值；DPPH*；抗氧化性；以色論質(zhì)；品質(zhì)評價(jià)

傳統(tǒng)認(rèn)為，某些商品中藥材一般具有較固定的外觀顏色或斷面顏色，藥材顏色變化與其內(nèi)在品質(zhì)有著密切的關(guān)系，因此它常作為商品藥材品質(zhì)評價(jià)的重要依據(jù)之一，如玄參、熟地要黑；丹參、紅花要紅；大黃、黃連以色黃為好，而金銀花的外觀顏色也作為評價(jià)其質(zhì)量優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)之一［1-2］。然而，這些多是對前人長期經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)與升華，其評判標(biāo)準(zhǔn)亦是建立在感官的主觀判斷基礎(chǔ)上，因此有待于采用現(xiàn)代技術(shù)手段對其進(jìn)行研究印證，并進(jìn)行客觀化、定量化和規(guī)范化研究。藥材顏色與內(nèi)在品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性研究的報(bào)道也較多見，其中多是藥材顏色與有效成分之間的關(guān)聯(lián)研究，但是中藥成分復(fù)雜、藥效物質(zhì)不明，一個(gè)或數(shù)個(gè)指標(biāo)性成分 （或有效成分）并不能全面代表中藥的內(nèi)在品質(zhì) （尤其是功效）。當(dāng)前，采用生物活性檢測的方法對中藥進(jìn)行質(zhì)量控制與品質(zhì)評價(jià)，能更關(guān)聯(lián)藥效及體現(xiàn)中藥特點(diǎn)，得到廣泛認(rèn)可［3-4］，如 “中藥生物活性測定指導(dǎo)原則”已被 《中國藥典》2010年版 （一部）附錄收載［5］。本實(shí)驗(yàn)以常用大宗藥材金銀花為示范，采用自行開發(fā)的 “中藥顏色辨識系統(tǒng)”，對其粉末顏色進(jìn)行客觀、定量地映射，并與其體外抗氧化活性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以闡釋金銀花的顏色與內(nèi)在品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性，為建立該藥材綜合的品質(zhì)評價(jià)方法提供支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 FW-100型高速萬能粉碎機(jī) （北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；KH2200DB型數(shù)控超聲波段清洗器 （昆山禾利超聲儀器有限公司）；SHZDIII型循環(huán)水真空泵 （鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；GO型全波段酶標(biāo)儀 （美國熱電集團(tuán)）；中藥顏色辨識系統(tǒng) （自制）。

1.2 試劑與藥材 DPPH*（美國Sigma公司）。無水乙醇為分析純 （天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；雙蒸水 （自制）。陽性對照物 （維生素E膠丸，青島雙鯨藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20043134，批號001008）。金銀花購自多家藥材市場及醫(yī)院藥房，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定，均為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花。

2 原理與方法

2.1 金銀花顏色辨識

2.1.1 原理

2.1.1.1 顏色數(shù)據(jù)的采集與處理原理 顏色通?？梢杂眉t （R）、綠 （G）、藍(lán) （B）3種基色來定義，可采用三維空間來進(jìn)行描述，把3種基色的數(shù)值當(dāng)做歐幾里得空間中普通笛卡爾坐標(biāo)系的坐標(biāo)值（圖1）。水平的X軸代表紅色，向左增加；Y軸代表藍(lán)色，向右下方向增加；豎直的Z軸代表綠色，向上增加。三個(gè)方向坐標(biāo)值均為最大的頂點(diǎn)代表白色，為正對著的凸出頂點(diǎn)；原點(diǎn)代表黑色，遮擋在立方體背面。在RGB模型中，使用0到1之間的非負(fù)數(shù)作為立方體的坐標(biāo)值，如若對比黑色的程度，便將原點(diǎn) （0，0，0）作為黑色，強(qiáng)度值沿坐標(biāo)軸方向遞增到達(dá)位于對角線 （1，1，1）處的白色。

中藥顏色辨識程序是以三基色原理建立的三維的RGB顏色空間，對中藥圖像的顏色進(jìn)行提?。▓D像顏色提取裝置由無影燈箱、攝像頭及計(jì)算機(jī)組成，見圖2）。

2.1.1.2 顏色對比算法原理 本軟件具有單點(diǎn)映射功能及區(qū)域綜合映射功能，以單點(diǎn)映射為例，通過鼠標(biāo)獲取所指像素點(diǎn)P在電腦屏幕中的坐標(biāo) （i，j），得出該點(diǎn)映射到RGB顏色空間中的r，g，b三個(gè)分量，并實(shí)時(shí)在坐標(biāo)右側(cè)的顏色框中顯示其復(fù)合色。對于RGB顏色空間的任意兩個(gè)點(diǎn)，則可看作由坐標(biāo)原點(diǎn) （0，0，0）到該點(diǎn)的向量（ri，gi，bi） 和（ri，gi，bi）。若兩個(gè)向量共線，則僅考慮矢量距離。對比映射時(shí)，程序先計(jì)算出該像素點(diǎn)與設(shè)定的原點(diǎn)向量的色差，再進(jìn)行歸一化處理和單點(diǎn)映射。單點(diǎn)評估分值的計(jì)算公式如下。

圖1 中藥顏色辨識系統(tǒng)原理示意圖 （三基色編程原理）Fig.1 Princip le schematic of color identification system for traditional Chinese medicines（programm ing princip le based on three primary colors）

圖2 中藥顏色辨識系統(tǒng)原理示意圖 （顏色信息的提取）Fig.2 Princip le schematic of color identification system for traditional Chinese medicines（extraction of color inform ation）

通俗地講，本研究中將標(biāo)準(zhǔn)的藥材顏色映射值設(shè)定為向量原點(diǎn) （O），而其他與標(biāo)準(zhǔn)藥材有顏色差異的藥材顏色映射值 （P）與向量原點(diǎn)有一定距離 （圖3中O、P兩點(diǎn)之間的距離），距離越近，表示兩者之間顏色差異越小，反之亦然。我們規(guī)定，被測藥材顏色與標(biāo)準(zhǔn)藥材顏色基于特征向量的色差距離越近，則評估的映射值越高，見圖3。

2.1.2 操作方法 將藥材打粉，過40目篩，取10 g放入裝置A（圖1）底部中間，壓平，封閉裝置A并用固定光源照明，用通過A上方圖像采集系統(tǒng)，將藥材圖像色彩信息傳入給B（計(jì)算機(jī)系統(tǒng)）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，即將要評估的圖像區(qū)域加載到軟件中，進(jìn)行映射評估。

圖3 軟件編碼與評估算法原理示意圖Fig.3 Princip le schematic of softw are code and evaluation algorithm

2.2 金銀花體外抗氧化活性測定

2.2.1 原理 有研究表明，抗氧化是金銀花重要活性之一，與其清熱解毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫、抗炎等功效有關(guān)，所含黃酮類、有機(jī)酸、皂苷、綠原酸等成分均有體外抗氧化活性［6-8］。結(jié)合文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)采用體外清除DPPH*方法對所研究金銀花進(jìn)行抗氧化活性測定與評價(jià)［8-10］。

2.2.2 DPPH*溶液的制備 精密稱取DPPH*自由基40 mg，溶解于480 mL無水乙醇中，500 mL量瓶定容，得濃度為20 mmo1/mL的DPPH*溶液，避光保存 （0～4℃），即得。

2.2.3 陽性對照藥 （維生素E，VE）乙醇溶液的制備 取維生素E膠丸一粒 （100 mg/粒），剪破膠丸殼，加入無水乙醇5 mL溶解，搖勻，所得溶液即為20 mg/m L的維生素E溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 取干燥的金銀花藥材，粉碎，過40目篩，精密稱取2 g粉末，加入85%乙醇40 mL，超聲提取30 min，抽濾，將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，85%乙醇定容，得到質(zhì)量濃度為40 mg/m L的原液。使用時(shí)，稀釋成不同濃度。

2.2.5 加樣與檢測 將不同質(zhì)量濃度的樣品溶液分別取100μL，加樣在96孔板中，再在每孔中平行加入DPPH*溶液100μL，輕輕振蕩，使其充分混勻。再將96孔板放置在避光環(huán)境下反應(yīng)30 min，使藥物與自由基反應(yīng)完全，于波長517 nm處測定，記錄最終吸光度 （A）值，根據(jù)公式 （1）計(jì)算對DPPH*的清除率 （P）。清除率越高，則表明抗氧化性越強(qiáng)。

P=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100% （1）

注：Ac為DPPH溶液100μL+無水乙醇100μL的吸光度；Ai為DPPH溶液100μL+樣品溶液100 μL的吸光度；Aj為樣品溶液100μL+無水乙醇100μL的吸光度。

2.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行處理，藥物量效關(guān)系線性范圍采用直線回歸法求得；聚類分析采用系統(tǒng)聚類中的組內(nèi)聯(lián)結(jié)方法，并用樹狀圖顯示；相關(guān)分析采用雙變量分析中的皮爾遜相關(guān)法；樣品抑制DPPH*自由基的半數(shù)劑量值（IC50）采用Reed Muench法計(jì)算。

3 結(jié)果

3.1 金銀花顏色辨識測定結(jié)果精密度考察 按照“2.1”項(xiàng)原理與方法，將同一批金銀花粉碎并混勻后，平行制成5份樣品，分別進(jìn)行顏色識別映射。結(jié)果，記錄為58.08、57.30、59.88、63.20、62.04，平均值為60.10，RSD為4.19%，說明該識別系統(tǒng)對金銀花顏色識別映射結(jié)果的精密度較好。

3.2 不同批次樣品的外觀顏色與系統(tǒng)評分 對不同來源的金銀花粉末樣品進(jìn)行目測以辨別外觀顏色，并用 “中藥顏色辨識系統(tǒng)”映射，結(jié)果見表1。由表可見，肉眼只能大致辨別不同樣品的顏色差異，難以定量刻畫和表征，而使用 “中藥顏色辨識系統(tǒng)”映射后，可以對不同顏色樣品進(jìn)行定量表征。

表1 不同批次金銀花顏色映射值與抗氧化活性測定結(jié)果Tab.1 Result of determ ination of color reflect value and antioxidant activity in different batches of Lonicerae Flos

3.3 不同批次樣品的抗氧化活性 取與顏色映射值相同批次的樣品，按照 “2.2”項(xiàng)所示方法進(jìn)行抗氧化活性檢測，以前5批樣品為例，可得到不同量效關(guān)系曲線 （圖4）。

圖4 不同批次金銀花及VE的DPPH*清除率量效關(guān)系曲線Fig.4 Dose-effect cu rve of the ratio of scavenging DPPH* in different batches of Lonicerae Flos and VE

由圖可見，金銀花樣品具有良好的清除DPPH*活性，其量效關(guān)系與陽性對照藥VE具有相同趨勢，在一定濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)對稱的 “S”型曲線，再用對DPPH*自由基的半數(shù)清除濃度（IC50）表示其抗氧化能力的差異 （表1）。

3.4 以系統(tǒng)顏色映射值和IC50為變量聚類分析采用SPSS 19.0軟件包中的系統(tǒng)聚類分析程序，以16批金銀花樣品通過中藥顏色辨識系統(tǒng)的映射結(jié)果為變量，根據(jù)組內(nèi)聯(lián)結(jié)距離的大小，對樣品進(jìn)行聚類分組，樹形圖見圖5A。由圖可見，樣品間距離小于10時(shí)聚為1類，16個(gè)金銀花樣品可聚成2個(gè)大類。其中，樣品11#、13#為一類，而其他14種樣品歸為一類，表明11#、13#映射結(jié)果與其他類有較大差異。當(dāng)樣品間距離小于2時(shí)，樣品4#、6#、7#、8#聚為一類，樣品1#、2#、5#、12#聚為一類，樣品 10#、15#聚為一類，樣品3#、9#、14#、16#聚為一類，說明樣品間差異較大；當(dāng)距離小于5時(shí)，樣品1#、2#、4#、5#、6#、7#、8#、12#聚為一類，樣品3#、9#、10#、14#、15#、16#聚為一類，說明樣品間差異較小。

按同樣方法，以16批金銀花樣品清除DPPH*的IC50值為變量，根據(jù)組內(nèi)聯(lián)結(jié)距離的大小，對樣品進(jìn)行聚類分組，樹形圖見圖5B。由圖可見，當(dāng)樣品間距離小于10時(shí)聚為1類，16個(gè)金銀花樣品可聚成2個(gè)大類。其中，樣品11#、13#為一類，而其他14種樣品歸為一類，表明11#、13#映射結(jié)果與其他類有較大差異。當(dāng)樣品間距離小于5時(shí)，樣品1#、2#、5#、12#聚為一類，而其他10種樣品歸為一類，說明樣品間差異較??；當(dāng)樣品間距離小于3時(shí)，樣品10#、15#之間的距離最小，聚為一類，樣品3#、4#、6#、7#、8#、9#、14#、16#聚為一類。其中，樣品3#、4#、6#、7#、8#及樣品9#、14#、16#之間的距離更小，當(dāng)樣品間距離小于2時(shí)聚為一類。

圖5 以顏色映射值和IC50數(shù)據(jù)為變量聚類分析的樹形圖Fig.5 Dendrogram of cluster analysis of color reflect value and IC50data as variables

對圖5A和5B進(jìn)行比較后可以看出，以樣品顏色映射值和IC50分別進(jìn)行聚類分析時(shí)，均能把顏色為灰褐色的11#、13#（該2批樣品為市場上專門收集的陳年貨底，按經(jīng)驗(yàn)辨識為不合格品）聚為一類并挑出，而其他14種樣品歸類時(shí)的不同之處在于，顏色映射值的聚類分析認(rèn)為，樣品1#、2#、5#、12和4#、6#、7#、8#的距離較近，但I(xiàn)C50的聚類分析認(rèn)為，樣品1#、2#、5#、12#與其他10種樣品的距離較遠(yuǎn)并挑出。在對待樣品10#、15#時(shí)也有區(qū)別，顏色映射值的聚類分析認(rèn)為，樣品10#、15#和樣品3#、9#、14#、16#的距離較近，而IC50的聚類分析認(rèn)為，樣品10#、15#與其他8種樣品的距離較遠(yuǎn)并挑出。兩種聚類結(jié)果對待樣品3的態(tài)度也不一樣，顏色評分的聚類分析把樣品3#與樣品9#、14#、16#聚為一類，而IC50的聚類分析認(rèn)為，樣品3#與樣品4#、6#、7#、8#聚為一類。結(jié)合肉眼所視顏色進(jìn)行綜合評價(jià)，認(rèn)為樣品3#的歸屬以IC50聚類分析為宜。

由此可見，兩種方法的聚類結(jié)果均能很好評價(jià)金銀花的品質(zhì)。把顏色、品質(zhì)不好的11#、13#首先挑出，當(dāng)間距小于2時(shí)，樣品1#、2#、5#、12#（經(jīng)常規(guī)經(jīng)驗(yàn)鑒別，為品質(zhì)較優(yōu)的4個(gè)批次）在兩種方法的聚類結(jié)果上，均單獨(dú)聚為一類，完全一致。在操作上，利用中藥顏色辨識系統(tǒng)更加簡便快捷，而且與IC50的評價(jià)結(jié)果相比，誤差很小。

3.5 關(guān)聯(lián)分析 采用皮爾遜相關(guān)分析，結(jié)果見圖6。兩組數(shù)據(jù)線性關(guān)系為y=-0.014 9x+0.911 5，呈現(xiàn)極顯著的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=-0.997，P＜0.001。由于IC50值越大，代表樣品抗氧化活性越小，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金銀花顏色越接近淺綠色時(shí)，抗氧化活性也越強(qiáng)。

圖6 金銀花顏色映射值與清除自由基活性相關(guān)性分析Fig.6 Cor relation analysis of color reflect value and free rad ical scavenging activity of Lonicerae Flos

4 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)認(rèn)為，金銀花表面為 “綠白色”者質(zhì)較優(yōu)，如現(xiàn)行 《七十六種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，金銀花表面應(yīng)為 “綠白色”。在藥材加工或儲存中，金銀花顏色往往會有綠白、黃綠、黃白、黃棕等，若放置時(shí)間較久且包裝不嚴(yán)，易發(fā)生氧化反應(yīng)而變成深綠色，尤其是儲存時(shí)間較長且受高溫、光照、氧化等影響，藥材顏色甚至?xí)優(yōu)辄S棕色，此種情形可認(rèn)為其品質(zhì)下降或不合格，本實(shí)驗(yàn)的聚類分析以及皮爾遜相關(guān)分析結(jié)果也得出相同結(jié)論。

本實(shí)驗(yàn)選取有代表性的金銀花為示例，按常規(guī)《中國藥典》項(xiàng)目［5］檢測，以抗氧化活性測定及顏色辨識均最佳的樣品粉末作為對照的標(biāo)準(zhǔn)。在顏色辨識中，為保證藥材圖像采集時(shí)的均一性和代表性，經(jīng)對比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將一定數(shù)量藥材粉碎混勻后，以粉末顏色作為藥材的代表色較為適宜。因此，將本實(shí)驗(yàn)顏色辨識程序中規(guī)定的 “優(yōu)質(zhì)”藥材粉末顏色 （實(shí)驗(yàn)中 “綠白色”藥材成粉末后，目測顏色為 “淺綠色”）采集后輸入程序，為對比色——向量原點(diǎn)，離原點(diǎn)矢量距離越短之坐標(biāo)代表的顏色與標(biāo)準(zhǔn)藥材越接近。

另外，其他批次的金銀花樣品自動評估映射值越高者，其生物活性 （在一定程度上反應(yīng)金銀花內(nèi)在品質(zhì)）也越高，與有關(guān)研究報(bào)道一致［11］，這也驗(yàn)證了傳統(tǒng)上關(guān)于金銀花顏色與品質(zhì)關(guān)系的認(rèn)識。而本實(shí)驗(yàn)所建立的映射評估系統(tǒng)可以更加客觀、定量地刻畫金銀花粉末顏色，符合現(xiàn)代對藥檢方法的要求［12］。

此外，需要說明的是，作為示范性研究，試驗(yàn)中顏色映射值與系統(tǒng)條件的調(diào)試與設(shè)定有關(guān)，并不是固定的絕對值，各種條件 （照明光源、粉末處理標(biāo)準(zhǔn)、影像采集儀器、環(huán)境溫濕度等）有待于進(jìn)一步考察與優(yōu)化。與金銀花功效相關(guān)的生物活性測定方法除抗氧化外，還有解熱［13］、鎮(zhèn)痛、抗炎［14］、抗病原微生物［14-16］等均可選用，以便于從多角度、更全面地考察與反映金銀花內(nèi)在品質(zhì)。

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Quality evaluation of Lonicerae Flos based on the determ ination of color and anti-oxidation

WANG Lin-1in， WU Su-hui， LIHan-bing*， MA Xu-yang， WU Jin-ting
（College of Pharmacy，Henan University of Tranditional ChineseMedicine，Zhengzhou 450008，China）

AIMTo estab1ish amethod for the qua1ity eva1uation of Lonicerae Flos by quantified characterization of co1or and essentia1qua1ity.METHODSSixteen batches of Lonicerae Flos were respective1y powdered andsifted.Then the ref1ect va1ue ofpowder co1orwas setup based on three-primary co1or program.Antioxidantactivity of corresponding samp1ewas determined by e1iminating DPPH*peroxy radica1in vitro.C1uster and Pearson corre-1ation ana1ysis of the resu1ts of the two groups were performed.RESULTSCo1or identification system for Lonicerae Flos showed a stab1e performancewith the RSD of 4.19%（n=5）as co1or ref1ect va1ue.Strong negative corre1ation was noted（y=-0.014 9x+0.911 5，r=-0.997，P＜0.001）between the IC50e1iminating DPPH*in vitro of differentbatches and the resu1t of c1uster ana1ysis of ref1ect va1ue of powder co1or.It showed that the higher IC50of co1or，the 1ower antioxidant activity.CONCLUSIONThe co1ors ref1ect va1ue taking the p1ace of qua1ity eva1uation can serve as the objective description of Lonicerae Flos.

Lonicerae Flos；co1or；ref1ect va1ue；DPPH*；antioxidantactivity；qua1ity based on co1or；qua1ity eva1uation

R284.1

A

1001-1528（2015）08-1770-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.030

2014-11-09

河南省科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目 （102102310320）；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)資助項(xiàng)目 （14A310023）；河南中醫(yī)學(xué)院苗圃基金項(xiàng)目 （MP2011-06）；河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新學(xué)習(xí)項(xiàng)目 （YXCX［2014］22）

王琳琳，女，碩士，講師，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。Te1：15837189150，E-mai1：wo1frain201@126.com

*通信作者：李寒冰 （1973—），男，博士，副教授，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量評價(jià)和藥效學(xué)。Te1：13703920231，E-mai1：1hb8899@ 163.com