劉 薇， 王阿娜， 萬德光， 裴 瑾*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源系統(tǒng)化研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都611137；2.成都康美藥業(yè)有限公司，四川成都610041）

桑葉功能基因表達(dá)水平與多酚類成分積累的關(guān)聯(lián)分析

劉 薇1， 王阿娜2， 萬德光1， 裴 瑾1*

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源系統(tǒng)化研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都611137；2.成都康美藥業(yè)有限公司，四川成都610041）

目的對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段桑葉的功能基因表達(dá)水平與多酚類成分的動(dòng)態(tài)積累進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，尋找桑葉質(zhì)量差異的分子機(jī)制。方法HPLC法測(cè)定四川省成都市溫江區(qū)4月至11月期間桑葉中綠原酸、蘆丁和紫云英苷的含有量，然后實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定pal、chs和f3h 3種功能基因的表達(dá)量，計(jì)算其水平與多酚類成分含有量之間的相關(guān)性。結(jié)果蘆丁、紫云英苷和綠原酸的含有量在6月達(dá)到峰值，而且與pal和f3h基因表達(dá)水平相關(guān)性明顯，但與chs基因表達(dá)水平相關(guān)性較低。結(jié)論桑葉多酚類成分積累受pal和f3h基因調(diào)控作用較明顯，說明這兩個(gè)基因及其表達(dá)可用于研究桑葉品質(zhì)差異的分子機(jī)制。

桑葉；功能基因；pal；chs；f3h；多酚；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

桑葉始載于 《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品。《中國(guó)藥典》2010年版一部規(guī)定，桑葉為桑科植物桑Morus alba L.的干燥葉，其味甘、苦，性寒，歸肺、肝經(jīng)，具有清肺潤(rùn)燥、清肝明目、疏散風(fēng)熱的功效［1-2］。它含有豐富的多酚類成分，如黃酮、單寧、酚酸以及花色苷類等，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血壓、降血糖等生物活性，而綠原酸、蘆丁和紫云英苷等是其主要有效成分。前期研究發(fā)現(xiàn)［3-4］，不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的桑葉，其多酚類成分的含有量存在差異，而其中黃酮類成分的藥理活性被認(rèn)為與該植物傳統(tǒng)功效有一定關(guān)聯(lián)。

目前，對(duì)藥用植物有效成分代謝調(diào)控的研究主要是利用現(xiàn)代生物技術(shù)來考察其代謝途徑，以及對(duì)其遺傳特性進(jìn)行改造，進(jìn)而改變植物的次生代謝產(chǎn)物，提高有效成分含有量。在研究植物次生代謝途徑時(shí)發(fā)現(xiàn)，大部分物質(zhì)次生代謝的共有途徑之一為苯丙氨酸解氨酶（PAL）途徑。PAL在綠原酸和黃酮類物質(zhì)的合成途徑中都是位于起始點(diǎn)的一個(gè)關(guān)鍵酶［5-13］，而查耳酮合成酶 （CHS）位于黃酮類物質(zhì)合成途徑的上游位置，另外二氫黃酮-3-羥化酶（FHT或F3H，f1avanone-3-hydroxy1ase）與其他關(guān)鍵酶共同協(xié)調(diào)負(fù)責(zé)黃酮類的羥基化反應(yīng)［14-19］。

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)以分析pal、chs和f3h 3種功能基因的表達(dá)水平，并采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析法來研究這3種功能基因表達(dá)水平與綠原酸、蘆丁和紫云英苷動(dòng)態(tài)積累之間的相關(guān)性，初步探討其對(duì)有效成分動(dòng)態(tài)積累在次生代謝途徑中的影響，為在分子水平上深入揭示桑葉藥材質(zhì)量差異的形成奠定了基礎(chǔ)。

1 材料、試劑與儀器

桑葉采自于四川省成都市溫江區(qū)，為保證取樣科學(xué)性、數(shù)據(jù)可靠性以及足夠樣本量，故選取有一定代表性的兩個(gè)居群桑樹 （A和B）各3棵，由成都中醫(yī)藥大學(xué)萬德光教授鑒定為?？浦参锷orus alba L.的干燥葉。于2011年4月—11月中旬，每月采摘一次，現(xiàn)采現(xiàn)提RNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃冰箱中。

綠原酸、蘆丁對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢定所）；紫云英苷 （南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度98%）。甲醇為色譜純 （美國(guó)Fisher公司）；磷酸為分析純 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水 （自制）。Taq酶、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司）；SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR（東洋紡上海生物科技有限公司）；Agarose G-10瓊脂糖（香港基因有限公司）。Agi1ent 1200高效液相色譜儀 （包括化學(xué)工作站）、Agi1ent1260 DAD紫外檢測(cè)器（美國(guó)Agi1ent Techno1ogies公司）；電子天平（瑞士Mett1er To1edo公司）；超聲波清洗器 （昆山超聲儀器有限公司）；iCyc1er iQ熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期桑葉中綠原酸、蘆丁和紫云英苷的動(dòng)態(tài)積累

2.1.1 對(duì)照品和供試品溶液制備 根據(jù)文獻(xiàn)［20］報(bào)道的方法，制備這兩種溶液。

2.1.2 色譜條件 Diamonsi1 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸水溶液，梯度洗脫 （0～5 min，5%～25.5%甲醇；5～45 min，25.5%～48%甲醇；45～75 min，48%～64%甲醇；75～85 min，64%～80%甲醇；85～90 min，80%～90%甲醇；90～95 min，90%～95%甲醇；95～110 min，95%～100%甲醇）；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm；柱溫30℃；體積流量1.0 m L/min；進(jìn)樣量20μL。

2.1.3 線性關(guān)系和方法學(xué)考察 根據(jù)文獻(xiàn) ［20］報(bào)道的方法，對(duì)兩者進(jìn)行考察。

2.2 不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期桑葉功能基因表達(dá)量測(cè)定

2.2.1 總RNA的提取 采用TRNzo1法提取，具體操作方法見文獻(xiàn) ［21］。

2.2.2 cDNA第一鏈的合成 在冰塊上解凍模板RNA及Quant Reverse Transcriptase；在室溫（15～25℃）下解凍引物、10×RTmix、dNTPRNase-freeddH2O、混合液等，迅速置于冰上，渦旋振蕩，短暫離心后配制逆轉(zhuǎn)錄體系混合液，簡(jiǎn)短渦旋振蕩（不超過5 s），短暫離心后置于冰上。之后，加入模板RNA 5μL，充分混勻后短暫離心，37℃下孵育60 min，置于-20℃冰箱中保存。

2.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)桑葉3個(gè)功能基因pal、chs、f3h的序列，設(shè)計(jì)特異引物［22-23］，并以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物序列為pal F 5-GCCAGCAGTGATTGGGTTAT-3＇，R 5＇-CCTTGCTTGGTCCTCCTGT-3＇；pal F 5＇-AACATGTCGAGTGCGTGTGT-3＇，R 5＇-GTCTTGAGCCCATCTTCAGC-3＇；f3h F 5＇-CGTGCTGAGATTTGCAAGAA-3＇，R 5＇-AACGCCATGATCAACAACCT-3＇；β-actin F 5＇-AGGGGAAGCTGGCTTATGTT-3＇，R 5＇-CGGGCAGCTCATAGTTCTTC-3＇。

2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 取已制備好的4個(gè)基因?qū)φ掌?，稀?0倍，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在PCR板 （96孔）每孔中加入體系反應(yīng)液20μL，配方為正反游引物各1μL、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix 10μL、ddH2O 6μL、cDNA模板2μL。然后，陰性對(duì)照管中加入滅菌水20μL，擴(kuò)增條件為95℃下3 min后擴(kuò)增循環(huán)30個(gè)→95℃下變性30 s→pal基因58℃下退火30 s（chs和f3h基因56℃下退火30 s）→72℃下延伸20 s→相同溫度下再延伸2 min，4℃下保存。每份樣品均平行檢測(cè)3次，備用。

將4種基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和與檢測(cè)各樣品后得到的Ct相結(jié)合，計(jì)算每個(gè)樣品的定量結(jié)果，數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct法［19］，對(duì)照樣本選擇4月份的A樣品，待測(cè)樣本為剩余樣本，通過計(jì)算來比較各樣品間的相對(duì)表達(dá)水平差異，計(jì)算公式為相對(duì)表達(dá)量= 2-△△Ct。其中，ΔΔCt=ΔCt（剩余的待測(cè)樣本）-ΔCt（對(duì)照樣本）；ΔCt（對(duì)照樣本）=pal/chs/f3h（Mean Ct）4月1-參照基因β-actin（Mean Ct）4月1；ΔCt（待測(cè)樣本）=pal/chs/f3h（Mean Ct）n月-參照基因β-actin（Mean Ct）n月。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)所得的pal、chs和f3h基因，以及β-actin等4種基因的Ct值，分別計(jì)算居群A和B生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期各基因的表達(dá)差異。然后，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，考察基因表達(dá)水平和有效成分動(dòng)態(tài)積累之間的相關(guān)性。

3 結(jié)果

3.1 不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期桑葉有效成分含有量分析

計(jì)算不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期桑葉中綠原酸、蘆丁和紫云英苷的含有量情況，結(jié)果見表1。

表1 不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期桑葉有效成分含有量（%，n=3）Tab.1 Active ingredient contents ofmulberry leaves from different grow th stages（%，n=3）

由表可知，在不同生長(zhǎng)期的兩個(gè)居群桑葉中，蘆丁、紫云英苷和綠原酸的含有量均處于動(dòng)態(tài)變化中。例如，兩個(gè)居群中綠原酸的含有量均在5月為最低點(diǎn)，6月達(dá)峰值，之后呈整體下降趨勢(shì)；蘆丁的含有量在4月至6月均呈整體上升趨勢(shì)，6月至8月均呈下降趨勢(shì)，9月較高，之后呈整體下降趨勢(shì)，說明當(dāng)物種和生長(zhǎng)環(huán)境相同時(shí)，雖然有效成分在相同生長(zhǎng)期內(nèi)存在一定差異，但整體變化趨勢(shì)一致。

3.2 不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期桑葉功能基因表達(dá)量分析

計(jì)算不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期桑葉3個(gè)功能基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見表2。

表2 不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期桑葉pal、chs和f3h基因的相對(duì)表達(dá)量（n=3）Tab.2 Relative expressions of pal，chs and f3h in m ulberry leaves from different grow th stages（n=3）

由表可知，相同物種的桑葉雖然在相同時(shí)期的基因表達(dá)水平有所差異，但其整體變化趨勢(shì)是基本一致的。而且，在同一生長(zhǎng)發(fā)育階段，居群A和B的基因相對(duì)表達(dá)量也有所不同，說明遺傳物質(zhì)相同（即來源相同）的中藥材的基因相對(duì)表達(dá)量不同，但整體動(dòng)態(tài)趨勢(shì)一致。

3.3 不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期桑葉功能基因表達(dá)量與有效成分含有量的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)通過研究pal、chs和f3h基因在桑葉中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的桑葉中，這3個(gè)基因存在一定的相對(duì)表達(dá)差異。通過SPSS 19.0軟件，分析出兩種居群桑葉中pal、chs、f3h基因的相對(duì)表達(dá)量和蘆丁、紫云英苷、綠原酸含有量的相關(guān)性，結(jié)果見表3。

由表可知，3種基因的表達(dá)水平與兩個(gè)居群桑葉中綠原酸、蘆丁、紫云英苷以及其總含有量的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)基本一致。pal、f3h基因均分別與桑葉中蘆丁、綠原酸、紫云英苷含有量以及其總含有量之間存在一定的正相關(guān)，如居群A的相關(guān)系數(shù) （r）在0.20～0.70之間，居群B的r在0.40～0.75之間。其中，pal基因的表達(dá)水平與3種成分的含有量變化趨勢(shì)更為接近，上升趨勢(shì)均在4月—6月和8月—9月，下降趨勢(shì)均在6月—8月和9月—11月。另外，pal基因與居群B的3種多酚類成分總含有量顯著相關(guān)，并與居群A也有一定相關(guān)趨勢(shì)，r為0.656，而f3h基因與多酚類成分相關(guān)度較小，相關(guān)系數(shù)r在0.003～0.55之間。但chs基因和多酚類成分之間存在低度正相關(guān)，甚至不相關(guān)，如居群A的相關(guān)系數(shù)r僅在-0.20～0.46之間，而居群B的相關(guān)系數(shù)r僅在-0.55～-0.06之間。

表3 居群A、B多酚類成分與pal、chs、f3h基因表達(dá)水平的相關(guān)性（n=3）Tab.3 Cor relation between polyphenolic constituents and the expression levels of pal，chs and f3h in populations A and B（n=3）

4 討論

4.1 桑葉多酚類成分生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的調(diào)控作用 多酚類成分的生物合成能被植物不同發(fā)育時(shí)期和數(shù)種環(huán)境因子所調(diào)控和誘導(dǎo)，而且具有明顯的組織特異性。黃酮和綠原酸的生物合成途徑均屬于多酚類成分類型，并且均需在數(shù)個(gè)關(guān)鍵酶的催化下完成。在所選取的3個(gè)關(guān)鍵酶中，pal和chs均為前期酶，而f3h屬于中期酶，對(duì)次生代謝產(chǎn)物的積累有一定影響。本實(shí)驗(yàn)以未經(jīng)過人工調(diào)控的兩個(gè)居群桑葉為研究對(duì)象，將多酚類成分的動(dòng)態(tài)積累與3個(gè)關(guān)鍵酶的基因表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析，從而證實(shí)關(guān)鍵酶的催化作用，為研究桑葉品質(zhì)差異形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4.2 pal、chs和f3h基因與桑葉多酚類成分動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)性分析 本實(shí)驗(yàn)研究?jī)蓚€(gè)居群桑葉的原因有兩個(gè)，一是要保證取樣科學(xué)性、數(shù)據(jù)可靠性以及足夠樣本量，二是經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)居群桑葉的化學(xué)成分和基因相對(duì)表達(dá)量在相同時(shí)期雖有一定差異，但是這3種基因與多酚類成分的動(dòng)態(tài)積累變化趨勢(shì)基本一致。其中，相關(guān)性最大的是pal基因與多酚類成分，其次是f3h，而chs最小，推測(cè)可能是因?yàn)閜al基因處于合成途徑的首要位置，與其相關(guān)的代謝產(chǎn)物多于f3h和chs基因，即表明3種基因?qū)Χ喾宇惓煞志幸欢ㄕ{(diào)控作用，其中作用最大的是pal基因。另外，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵酶基因能有效調(diào)控桑葉次生代謝產(chǎn)物的合成，同時(shí)也為桑葉品質(zhì)形成的分子機(jī)制研究提供了可靠的依據(jù)。

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Correlation between expression level of functional genes and polyphenols'accumulation in mulberry leaves

LIUWei1， WANG A-na2， WAN De-guang1， PEI Jin1*

（1.Pharmacy College，Chengdu University of Traditional ChineseMedicine；TheMinistry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine；SystematicResearch，Developmentand Utilization ofChineseMedicineResources in Sichuan Province，Key Laboratory Breeding BaseofCo-founted by Sichuan Province and Ministry of Education，Chengdu 611137，China；2.Chengdu Kangmei Pharmaceuitical Co.，Ltd，Chengdu 610041，China）

AIMTo study the corre1ation between expression 1eve1of functiona1genes and po1ypheno1s'accumu1ation inmu1berry 1eaveswith different growth stages for investigating themo1ecu1armechanisms of action of this p1ant.METHODSThe HPLCmethod was app1ied to determining ch1orogenic acid，rutin and astraga1in in mu1-berry 1eaves co11ected from Wenjiang County（Chengdu City，Sichuan Province）from Apri1 to November in 2011.Then the expression 1eve1s of three functiona1genes（pal，chs and f3h）were investigated by quantitative rea1-time PCR method，whose corre1ation was ca1cu1ated.RESULTSThe contents of rutin，astraga1in and ch1orogenic acid reached the highest peak in June，showing high corre1ation with the expression of pal and f3h，but 1ow corre1ation with chs.CONCLUSIONThe expression 1eve1s of pal and f3h have c1ose re1ationships with po1ypheno1s'accumu1ation in mu1berry 1eaves，which can be used to study themo1ecu1armechanisms of the difference of qua1ity of mu1berry 1eaves.

mu1berry 1eaves；functiona1gene；pal；chs；f3h；po1ypheno1；quantitative rea1-time PCR

R284.1

A

1001-1528（2015）08-1747-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.025

2014-09-05

四川省科技廳項(xiàng)目 （2015TD0028）

劉 薇 （1979—），女，博士，講師，從事中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)及資源研究。Te1：13880898225，E-mai1：1wiu@163.com

*通信作者：裴 瑾 （1970—），女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)與資源研究。Te1：13880369322，E-mai1：peixjin@ 163.com