王斯璐 吳存造 潘曉東 洪煒龍 林成成 陳必成 白永恒

●論 著

白藜蘆醇對TGF-β1介導的腎小管上皮細胞表型轉化和Hedgehog信號的影響

王斯璐 吳存造 潘曉東 洪煒龍 林成成 陳必成 白永恒

目的 探討白藜蘆醇（Res）對轉化生長因子-β1（TGF-β1）誘導的腎小管上皮細胞（NRK-52E）表型轉化（EMT）的影響及其分子機制。方法 體外培養(yǎng)腎小管上皮細胞，分為對照組、誘導組（TGF-β1：5μg/L）、干預1組（TGF-β1+Res10μmol/ml）和干預2組（TGF-β1+Res100μmol/ml）。采用細胞免疫熒光和qRT-PCR技術檢測EMT、細胞外基質和Hedgehog信號相關分子表達水平。結果 TGF-β1作用NRK-52E細胞后，不僅促進其受體TGF-β1R表達（P＜0.05），且肌成纖維細胞標志物（α-SMA）和基質成分Ⅲ型膠原的表達增加，上皮細胞標志物（E-cadherin）表達下降。應用Res干預后，不僅抑制甚至逆轉了上述結果，且抑制了TGF-β1介導的MMP-2/TIMP-2比值下降（P＜0.05），促進基質成分降解。此外，Res也抑制TGF-β1誘導的PCNA表達上調（P＜0.05），以及增殖相關的Hedgehog信號（Shh、Ptch1和Gli1）活化（P＜0.05）。結論 Res可能通過拮抗Hedgehog信號來抑制TGF-β1所誘導的NRK-52E細胞增殖、EMT和細胞外基質累積。

白藜蘆醇 轉化生長因子-β1 表型轉化 腎小管上皮細胞 Hedgehog信號

腎小管細胞上皮間質表型轉化（EMT）是指在某些特殊的生理或病理條件下，腎小管上皮細胞異常增殖，失去自身的細胞特性而獲得肌成纖維細胞的特性。活化的肌成纖維細胞可以過度分泌細胞外基質成分，如Ⅰ型和Ⅲ型膠原在腎間質間隙累積，從而導致腎間質纖維化的發(fā)生[1]。因此，抑制或逆轉EMT的發(fā)生和發(fā)展以及改善腎間質成份的累積已成為控制腎間質纖維化的重要途徑之一[2]。近年有研究顯示，從葡萄皮中分離的一種成分白藜蘆醇（Res）具有抑制多種組織纖維化的作用[3]，然而其分子機制尚未明確。目前，轉化生長因子-β1（TGF-β1）被證實可以調節(jié)EMT過程，且是最重要的誘導因子之一[4]。因此，本研究擬通過TGF-β1來誘導腎小管上皮細胞（NRK-52E）EMT和基質累積，探討Res對NRK-52E的EMT和細胞增殖相關的Hedgehog信號的影響及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器 大鼠腎小管上皮細胞系（NRK-52E）購于中國科學院上海細胞庫。主要試劑：Res（上海源葉生物公司）、TGF-β1（美國PeproTech公司）、Ⅲ型膠原

和增殖細胞核抗原PCNA抗體（中國Bioworld公司）；上皮細胞標志物鈣黏蛋白（E-cadherin）（美國Abcam公司）；α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、patched-1（Ptch1）、Gli1和smoothened（Smo）抗體（美國Santa Cruz公司）、TRIzol reagent（美國 Invitrogen公司）、ReverTra Ace qPCR RT kit（日本Toyobo公司）、SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus（日本Toyobo公司）、引物由美國Invitrogen公司合成，見表1。主要儀器：7500 Real-Time PCR System（美國LifeTechnologies公司）、MyCycler梯度PCR儀（美國BioRed公司）、DM4000B LED熒光正置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

表1 Hedgehog信號和纖維化相關基因的mRNA特異性引物

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 NRK-52E細胞于DMEM（含5%胎牛血清、100U/ml penicillin和100mg/ml streptomycin）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)。當6孔板中細胞密度達到70%時將完全培養(yǎng)基替換成無血清培養(yǎng)基，同步24h后加入TGF-β1或Res。根據文獻[5]將NRK-52E細胞分為4組：（1）對照組：未加入Res和TGF-β1；（2）誘導組：只加入TGF-β1（5μg/ L）；（3）干預1組：TGF-β1+Res10μmol/ml，干預2組：TGF-β1+Res100μmol/ml。

1.2.2 細胞免疫熒光染色 NRK-52E細胞經細胞爬片，TGF-β1或Res處理24h后，加入4%多聚甲醛固定，之后加入0.1%Triton X-100破膜處理10min，并用10%FBS封閉來消除非特性的熒光顯色。應用PCNA（細胞增殖的關鍵蛋白）、Ⅲ型膠原（基質成分）、α-SMA（肌成纖維細胞標志物）、E-cadherin（上皮標志物）、Ptch1、Smo和Gli1（Hedgehog信號通路成分）的一抗，以及DyLight 488/594標記的二抗處理后，用抗淬滅封片劑封片，最后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 qRT-PCR 用TRIzolreagent提取細胞總RNA，并于260/280nm測定吸光度值，分析樣本純度和濃度，再用ReverTra Ace qPCR RT kit將RNA逆轉錄成cDNA，最后用SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus進行實時定量PCR，PCR程序為：95℃3min預變性，1個循環(huán)；95℃5s，60℃35s，40個循環(huán)。應用Primer 5.0軟件設計引物，以β-actin作為內參對照。得到的結果用ΔΔCt法分析。相對表達量=2－ΔΔCt，ΔΔCt=[Ct目的基因（待測樣品）-Ct內參（待測樣品）]-[Ct目的基因（校正樣品）-Ct內參（校正樣品）]。同時采用熔解曲線分析以評價PCR結果的可靠性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 Res對TGF-β1處理的NRK-52E細胞的EMT和基質的影響 見插頁圖1和表2。

由圖1可見，免疫熒光染色結果顯示，TGF-β1處理NRK-52E細胞后，肌成纖維細胞標志物α-SMA和基質成分Ⅲ型膠原表達增加，上皮標志物E-cadherin表達下降。由表2可見，TGF-β1不僅誘導使其受體TGF-β1R mRNA的表達升高（P＜0.05），而且也促進纖連蛋白、S100A4、Ⅰ型膠原和TIMP-2 mRNA表達水平顯著上升和MMP-2 mRNA表達下降（P＜0.05或0.01）。低濃度的Res（10μmol/ml）即可抑制甚至逆轉以上結果，而高濃度的Res（100μmol/ml）對EMT和基質的影響更顯著。

表2 EMT和細胞外基質相關分子表達

2.2 Res對TGF-β1處理的NRK-52E細胞的PCNA表達的影響 見插頁圖2。

免疫熒光染色檢測PCNA表達顯示：PCNA陽性/總細胞數分別為對照組0.68±0.13、誘導組0.77±0.15，干預1組0.35±0.06，干預2組0.30±0.05。誘導組PCNA的表達相對于對照組略微增加；干預1組、干預2組PCNA的表達低于誘導組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。可見TGF-β1作用NRK-52E細胞后，PCNA的表達量增加。而Res可以抑制TGF-β1引起的NRK-52E細胞PCNA表達水平上調。

2.3 Res對TGF-β1處理的NRK-52E細胞的SHH信號相關分子表達 見插頁圖3及表3。

表3SHH信號相關分子表達

由圖3可見，TGF-β1能上調受體Smo和轉錄因子Gli1的表達，同時下調細胞膜受體Ptch1的表達，而Res抑制甚至逆轉以上結果。由表3可見，TGF-β1能上調分泌型蛋白配體Shh和Gli1的表達，同時下調Ptch1的表達（均P＜0.05），而Res抑制了Shh和Gli1的表達，上調Ptch1的表達（均P＜0.05）。

3 討論

腎間質纖維化的病理學特征表現為基質成分的合成和降解的失衡，導致其在腎間質的廣泛累積[1，6]。肌成纖維細胞是體內最主要的基質產生細胞，而肌成纖維細胞可能來源于EMT。因此，研究EMT對于腎纖維化防治具有十分重要的意義。本研究中，NRK-52E細胞經TGF-β1處理后，上皮細胞標志物表達下降，而肌成纖維細胞標志物和基質成分的表達明顯增高，說明TGF-β1成功誘導了腎小管上皮細胞的EMT和基質累積。

Res是一種含有芪類結構的植物抗毒素，從葡萄或者其他水果的表皮上即可分離得到。Res不僅具有抗炎、抗氧化和抑制血小板凝集等生物學活性[7]，而且也可抑制多種組織的纖維化[3]。然而，Res抗纖維化的分子機制尚未明確。本研究發(fā)現，在體外培養(yǎng)的腎小管上皮細胞中，TGF-β1引起的EMT和基質改變可以被低濃度的（10μmol/ml）Res所抑制甚至逆轉，而100μmol/ml Res的影響更為顯著，表明了Res對TGF-β1處理的NRK-52E細胞的EMT和基質的影響可能呈現為濃度依賴性。TIMP-2和MMP-2屬于基質金屬蛋白酶家族，在正常生理情況下如胚胎發(fā)育和組織重建中參與基質的降解[8]。Res可以抑制TGF-β1引起的MMP-2/TIMP-2比值的下降，提示Res抑制細胞外基質的累積是通過促使基質降解和抑制其合成，最終使基質成分減少，減輕腎纖維化[6]。Yang等[9]研究表明異常的細胞增殖可能是引起EMT的重要原因。我們研究發(fā)現，TGF-β1處理NRK-52E細胞后，增殖細胞核抗原PCNA表達上升，然而我們并未發(fā)現細胞數量的增多，這說明PCNA表達升高主要是細胞的異常增殖過程，即發(fā)生EMT，形成新的亞型。而Res則能使PCNA表達顯著下降，我們推測Res抑制EMT進程可能和調控細胞增殖的Hedgehog信號通路相關。Hedgehog信號是一條與細胞增殖密切相關的信號通路，該通路主要由分泌型蛋白配體Shh、細胞膜受體Ptch和Smo以及轉錄因子Gli構成，在細胞分化、胚胎發(fā)育及組織修復等過程中發(fā)揮重要作用[10]。以前研究發(fā)現Res可以通過抑制胰腺癌細胞中的Hedgehog信號，進而抑制細胞增殖，誘導其凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。Huang等[11]發(fā)現Res通過調控SHH信號來調節(jié)骨髓間充質細胞的分化。這些研究結果表明了Hedgehog信號與腫瘤等增殖性疾病的發(fā)生、發(fā)展關系密切。本研究結果顯示，TGF-1能上調Shh、Smo和Gli1蛋白的表達，同時下調Ptch1表達，這說明TGF-β1能誘導Hedgehog信號的活化。而活化的Hedgehog信號可能是上皮細胞的異常增殖的關鍵。Res通過調控上皮細胞的異常增殖進而影響EMT進程，那么Res是否參與Hedgehog信號的調控？結果顯示Res增加了Ptch1的表達，下調了Smo和Gli1的表達，說明Res可以抑制TGF-β1誘導的NRK-52E細胞的Hedgehog信號活化。然而，本研究對Res對Hedgehog信號的調控方式以及作用靶點沒有深入研究。因此，需要進一步明確Res和Hedgehog信號的關系，并深入探討其與TGF-β1和EMT等關系，為實現Res治療腎纖維化研究提供依據。綜上所述，Hedgehog信號通路可能參與Res抑制腎纖維化的過程，為Res對治療腎纖維化的臨床用藥提供理論依據。

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Effectof resveratrol on TGF-β1-mediated epithelial-mesenchymal transition and hedgehog signaling in renal tubular epithelialcells

WANG Silu,WU Cunzao,PAN Xiaodong,et al.
Laboratory of Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the effect of resveratrol(RES)on TGF-β1-mediated epithelial-mesenchymal transition(EMT)in renal tubular epithelial cells and its molecular mechanism. Methods Renal tubular epithelial NRK-52E cells were divided into control group,TGF-β1 group(EMT was induced by 5μg/L TGF-β1),treatment group 1 and 2(EMT-induced cells were treated with res 10 or 100μmol/ml).qRT-PCR and immunofluorescence staining were performed to evaluate the mRNA and protein expression of EMT,extracellular matrix,and Hedgehog signaling molecules. Results After treated with TGF-β1, NRK-52E cells were transited from epithelial phenotype to mesenchymal phenotype,accompanied with down-regulated expression of epithelial marker(E-cadherin)and up-regulated expression of TGF-β1R(P＜0.05),mesenchymal markers(α-SMA)and matrix components(TypeⅢcollagen),which were inhibited or reversed by resveratrol treatment.In addition,resveratrol inhibited TGF-β1-mediated down-regulation of MMP-2/TIMP-2,resulting in the degradation of matrix components.Resveratrol also abolished up-regulated expression of PCNA (P＜0.05),and activation of hedgehog signaling (Shh,Ptch1 and Gli1)induced by TGF-β1 in NRK-52E cells(P＜0.05). Conclusion Resveratrol can inhibit TGF-β1-induced proliferation,EMT and matrix deposition in NRK-52E cells via the hedgehog pathway.

ResveratrolTransforminggrowth factor β1(TGF-β1) Epithelial mesenchymal transition(EMT) Renal tubular epithelial cells Hedgehog signaling

2014-12-10）

（本文編輯：楊麗）

浙江省自然科學基金（LQ12H05001，LY12H05004）；溫州市科技計劃項目（Y20110028）

325000 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院外科實驗室（王斯璐、洪煒龍、林成成、陳必成、白永恒），移植科（吳存造、潘曉東）

白永恒，E-mail：greatsailor@163.com