鐘澤 胡家慶 胡新央 蔣峻 吳新東 相鵬

Myocardin相關轉錄因子 -A
對缺氧缺血誘導的大鼠心肌細
胞凋亡的影響

鐘澤 胡家慶 胡新央 蔣峻 吳新東 相鵬

目的 研究Myocardin相關轉錄因子-A（MRTF-A）對缺氧缺血誘導的心肌細胞凋亡的影響及機制。方法 20只大鼠采用隨機數(shù)字表分為假手術組和缺血再灌注組。假手術組大鼠實行開胸手術但不構建缺血再灌注模型，缺血再灌注組結扎冠狀動脈30min再松開2h建立在體心肌缺血再灌注損傷模型。采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，免疫組化法檢測MRTF-A表達；體外培養(yǎng)大鼠原代心肌細胞，轉染MRTF-A及小分子mRNA表達質粒并構建缺氧缺血模型。通過流式細胞術檢測細胞凋亡率，以Western blot法分析凋亡相關基因bcl-2蛋白表達；采用熒光素酶檢測bcl-2轉錄活性。結果 假手術組和缺血再灌注組的心肌凋亡細胞分別為（8.14±2.33）%和（82.35±7.93）%，缺血再灌注組高于假手術組（P＜0.05）。假手術組有少量MRTF-A蛋白表達，缺血再灌注組胞漿中有大量MRTF-A蛋白表達。在體外培養(yǎng)的原代心肌細胞中，對照組、模型組、MRTF-A處理組與MRTF-A抑制組的凋亡率分別為（4.63+2.33）%、（79.97+9.09）%、（43.63+3.52）%和（72.16+5.37）%；bcl-2的蛋白表達分別為0.313+0.014、0.186+0.019、0.254+0.013與0.175+0.017。模型組凋亡率高于對照組（P＜0.01），MRTF-A處理組的凋亡率低于模型組（P＜0.01）；MRTF-A抑制組的凋亡率高于MRTF-A處理組（P＜0.05）；模型組bcl-2的蛋白低于對照組（P＜0.01），MRTF-A處理組的bcl-2的蛋白高于模型組（P＜0.01）；MRTF-A抑制組的bcl-2的蛋白低于MRTF-A處理組（P＜0.05）；MRTF-A對bcl-2的轉錄活性的調控與對照組相比明顯升高（P＜0.01），而MRTF-A對突變后的bcl-2的轉錄活性與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論 缺血再灌注損傷誘導了大鼠心肌細胞凋亡，上調了心肌組織中MRTF-A的蛋白表達；MRTF-A通過上調bcl-2的轉錄活性表達起到對缺氧缺血誘導的大鼠原代心肌細胞凋亡損傷的保護作用。

Myocardin相關轉錄因子-A 缺血再灌注 心肌凋亡

【 Abstract】 Objective To observe the effect of myocardial myocardin-related transcription factor-A (MRTF-A)on myocardium apoptosis and its mechanism. Methods 20 rats were randomly divided into sham and ischemia-reperfusion(myocardial ischemia30-min and reperfusion 2h)group (n=10 each).TUNEL was used to detect cardiomyocyte apoptosis,the MRTF-A expression was detected by immunohistochemistry.One day neonatal rat ventrical was used as cell culture and hypoxia-no glucose damaged myocardial cell before over-expression of wild-type MRTF-A or siRNA in myocardial cell.The apoptosis rate was measured by FCM.The bcl-2 expression was analyzed by western blot.The bcl-2 transcriptional activity was detected by luciferase. Results The number of apoptotic cardiomyocytes in the sham group and ischemia-reperfusion group were (8.14± 2.33）%and(82.35±7.93)%,respectively(P＜0.05).The protein expression of MRTF-A in the sham group were significantly lower than those in ischemia-reperfusion group.In cultured neonatal rat cardiomyocyte,the apoptotic of control group,model group, MRTF-A transfection group and siRNA transfection group were (4.63+2.33)%、(79.97+9.09)%、(43.63+3.52)%、(72.16+5.37)%；The protein expression of bcl-2 were 0.313+0.014、0.186+0.019、0.254+0.013、0.175+0.017.Over-expression of wild-type MRTF-A upregulated the transcription activity of bcl-2 reporter gene,but the mutation bcl-2 reporter gene. Conclusion The expression of MRTF-A had changed that induced by ischemia-reperfusion.MRTF-A promoting myocardial survival against apoptosis induced by hypoxia-no glucose via up-regulation bcl-2 transcription activity.

【Key words】 Mocardial myocardin-related transcription factor-A Ischemia-reperfusion Myocardial apoptosis

血液供應阻斷30min以上即可導致心肌細胞不可逆的損傷甚至死亡，及時恢復血供被視為挽救部分心肌細胞功能的重要措施[1-2]。然而，心肌得到血液再灌注后，不僅功能未得到恢復，反而使心肌損傷加重，出現(xiàn)心率失常、梗死面積擴大等病變[3-4]。SAP蛋白家族的Myocardin相關轉錄因子MRTF-A均由807個氨基酸殘基組成[5-7]，其表達較廣泛，參與心肌的基因轉錄調控。研究發(fā)現(xiàn)，在心肌細胞中，表達野生型MRTF-A能夠誘導心肌肥大及新生鼠原代心肌細胞的血管發(fā)育相關基因表達。另有文獻報道，在心肌梗死時MRTF-A可調控成纖維細胞的活性和纖維癥。因此，MRTF-A對心肌細胞的發(fā)育、生長、凋亡發(fā)揮重要作用。但MRTF-A對CArG box依賴基因轉錄調控的機制尚未闡明。為此，本研究擬在體大鼠心肌缺血再灌注時觀察MRTFA表達，同時檢測在體外低氧誘導的心肌細胞凋亡時，MRTF-A對細胞凋亡的影響及對靶基因即抗心肌細胞凋亡的基因（bcl-2）表達的調控，初步探討MRTF-A對大鼠缺氧缺血誘導的心肌細胞凋亡的影響的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料及儀器 健康成年SD雄性大鼠20只,購自中國科學院上海實驗動物中心，清潔級，體重270～310g。野生型MRTF-A表達質粒、小分子mRNA表達質粒及bcl-2報告基因質粒由上海生工生物公司構建?？贵wMRTF-A和bcl-2由美國Santa Cruz公司提供。轉染試劑購自瑞士Roche公司。凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司。免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供。HX-300動物呼吸機購自中國成都泰盟科技有限公司。垂直電泳、電轉槽、電泳儀購自北京君意東方電泳設備有限公司。流式細胞儀為美國BD產品。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 采用隨機數(shù)字表法分為兩組：假手術組，缺血再灌注組，每組10只。缺血再灌注組：以10%水合氯醛于大鼠腹腔注射進行麻醉，對大鼠行氣管切開，動物呼吸機輔助大鼠呼吸，呼吸頻率60次/min，潮氣量18ml/kg，于大鼠四肢皮下插入針形電極，記錄心電圖，沿大鼠胸骨左緣第2、3、4肋間行縱向切口開胸，破開胸膜及心包膜，暴露心臟。于大鼠心臟左冠狀動脈前降支起始部，用6-0號醫(yī)用縫合絲線穿過心肌淺表層，穩(wěn)定30s，將絲線兩端同時穿入一直徑1mm，長2cm的塑管，將塑管垂直壓向大鼠心臟，勒緊絲線，阻斷大鼠左冠狀動脈前降支血流，達到結扎目的，造成心肌缺血。以心臟局部缺血，發(fā)紺，心電圖ST段抬高為缺血成功。缺血30min后，松開塑管，恢復灌注，灌注2h。假手術組：僅暴露心臟，不做心肌缺血再灌注處理。

1.2.2 原位末端（TUNEL）法檢測細胞凋亡 取大鼠正常及缺血再灌注的組織，依次進行10%中性緩沖甲醛固定、石蠟包埋、切片。將組織石蠟切片經脫蠟水化后，用0.1% Triton X-100和0.1%檸檬酸鈉溶液通透，將通透好的切片用PBS漂洗瀝干，用血清封閉30 min，PBS漂洗3次，按照比例加入末端標記酶和標記液配置成的TUNEL反應工作液，放入濕盒避光30℃，孵育1 h，將處理好的組織用甘油封片。細胞核染色呈棕黃色或棕紅色定義為細胞染色陽性，在Olympus-CH光學顯微鏡下計算10個高倍鏡視野，陽性細胞除以總細胞數(shù)計算平均陽性率（%）。

1.2.3 免疫組化檢測MRTF-A表達 取大鼠正常及缺血再灌注的組織，依次進行10%中性緩沖甲醛固定、石蠟包埋、切片。將切片浸入0.01 mol/L（pH 6.0）檸檬酸鹽緩沖液中，于微波爐中加熱至100℃、持續(xù)5min，反復2次。室溫自然冷卻后，用0.1mol/L PBS洗滌5min×2次。滴加封閉液羊血清置室溫20min，甩去多余的液體。滴加1∶50抗體，陰性對照以PBS代替1抗，于4℃孵育過夜，以0.1mol/L PBS洗滌5min×3次。滴加生物素標記2抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗5min×2次。使用DAB顯色試劑盒，室溫顯色，鏡下控制反應時間，自來水沖洗。滴加蘇木素輕度復染后，依次進行脫水、透明、中性膠封片及顯微鏡觀察。

1.2.4 原代心肌細胞培養(yǎng)及分組 取新生1d的SD乳鼠（雌雄均可），在無菌條件下取其心室肌剪碎，經0.1%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，離心收集后，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成濃度為5×105/ml細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)的細胞分為4組：對照組（將培養(yǎng)的心肌細胞轉染pGL3空載體）、模型組（將培養(yǎng)的心肌細胞轉染pGL3空載體36h后，再行缺血缺氧處理）、MRTF-A處理組（將MRTF-A表達質粒轉染入心肌細胞36h后，再行缺血缺氧處理）、MRTF-A抑制組（將MRTF-A及MRTF-A小分子mRNA表達質粒轉染入心肌細胞36h后，再行缺血缺氧處理）。

1.2.5 心肌細胞缺血缺氧處理 將培養(yǎng)3d同步搏動的心肌細胞換用高純氮氣飽和的無血清DMEM培養(yǎng)基，并于培養(yǎng)瓶內充氮氣1min，將瓶內空氣置換出。放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱密閉培養(yǎng)，造成心肌細胞缺血缺氧損傷。于12h后行流式細胞術或Western blot法檢測指標。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數(shù)生長期的細胞，用0.125%胰蛋白酶消化后調節(jié)密度為1×108/L接種于12孔板中，每孔2ml，經前期處理后，用細胞凋亡檢測試劑盒內的緩沖液300L重懸，加入5μlannexin V-FITC混勻后，加入5μl碘化丙啶混勻室溫避光反應10min，最后在1h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 Western bloting檢測bcl-2表達 取大鼠心臟缺血部位的組織加入裂解液勻漿，12 000r/min離心5min，取上清液測蛋白濃度。將上清液與6×loading buffer混合后，沸水浴加熱5min，離心取上清液。于4℃凝膠電泳，電轉移1h至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉溶液4℃封閉過夜，加入1抗體室溫孵育2h，TTBS洗膜3× 10min，加入HRP標記的2抗，室溫孵育膜2h，TTBS洗膜4×15min。曝光底片，掃描保存為電腦文件，用Quantity One 4.62軟件將條帶的灰度值數(shù)字化。以actin作內參照，目的條帶與其相比得到相對量。

1.2.8 bcl-2轉錄活性檢測 在1.2.4中實驗分組的基礎上，細胞處理后，吸棄培養(yǎng)基，用冰PBS沖洗2次，加入1×細胞裂解液100 μl放置于搖床室溫振蕩15 min，確保細胞與裂解液充分接觸直至完全溶解。將雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒中的熒光素酶檢測緩沖液和熒光素酶底物混合均勻后，加入到細胞溶解液中。即刻上機檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD-t檢驗。相關性分析采用Pearson直線相關分析法。

2 結果

2.1 缺血再灌注損傷對心肌細胞凋亡的影響 見插頁圖1。

由圖1可見，假手術組心肌細胞形態(tài)正常，規(guī)則界限清晰，細胞核著色為淺黃，TUNEL陽性反應細胞（即凋亡細胞）較少，凋亡細胞為（8.14±2.33）%；心肌缺血30min再灌注2h心肌組織中可見較多TUNEL陽性反應細胞，凋亡細胞主要呈現(xiàn)為深棕色，凋亡細胞為（82.35±7.93）%，缺血再灌注組高于假手術組（P＜0.05）。

2.2 缺血再灌注損傷對心肌組織中MRTF-A表達的影響 見插頁圖2。

由圖2可見，MRTF-A蛋白表達的陽性部位主要在胞漿中，在高倍鏡下可見胞漿內有棕黃色的小顆粒。在假手術組心肌組織中，胞漿內可見少量陽性染色區(qū)域；缺血再灌注組有大量胞漿染色呈棕黃色，MRTF-A蛋白表達為強陽性。

2.3 MRTF-A對缺氧缺血誘導的原代心肌細胞凋亡的影響 見圖3。

由圖3可見，對照組凋亡率（4.63+2.33）%，模型組（79.97+9.09）%，MRTF-A處理組（43.63+3.52）%，MRTF-A抑制組（72.16+5.37）%。與對照組相比，模型組凋亡率明顯升高（P＜0.01），而MRTF-A處理組的凋亡率較模型組明顯降低（P＜0.01），同時，MRTF-A抑制組的凋亡率較MRTF-A處理組升高（P＜0.05），而與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 MRTF-A對抗凋亡基因bcl-2蛋白表達及轉錄活性的影響 見圖4。

由圖4A、B可見，模型組bcl-2表達量0.186+ 0.019，較對照組（0.313+0.014）降低（P＜0.01）；與模型組相比，MRTF-A處理組bcl-2表達量（0.254+0.013）增加（P＜0.05）；另外，MRTF-A抑制組bcl-2表達量0.175+0.017，較MRTF-A處理組下降（P＜0.05），而與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由圖4C可見，模型組與對照組對比，bcl-2轉錄活性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；MRTF-A處理組bcl-2轉錄活性與模型組比較明顯上調（P＜0.01）；但MRTF-A抑制組的 bcl-2轉錄活性較MRTF-A處理組顯著下降（P＜0.01），較模型組升高（P＜0.01）。

3 討論

心肌缺血性壞死而導致的心肌梗死是引起患者猝死的主要心血管疾病，在我國呈逐年上升的態(tài)勢，嚴重威脅人們健康及生命安全。目前，心肌梗死誘導心室重構及后期細胞凋亡被認為是主要的機制之一，心肌細胞凋亡程序如何啟動、在疾病發(fā)生、發(fā)展及治療過程中又如何調控尚未研究明確。目前臨床治療主要是促進缺血心肌再灌注，雖然再灌注可以改善心肌的血液供應，但也會加重心肌缺血所造成的損傷，導致心肌梗死面積擴大，細胞炎癥反應，再灌性心律失常等，影響患者的預后。

MRTF-A在Myocardin介導的心肌等平滑肌細胞生長、發(fā)育、存活、增殖或凋亡功能中發(fā)揮重要作用。業(yè)已證明，心肌梗死激活Rho信號途徑，引起胞質內G-肌動蛋白池的減少，使G-肌動蛋白從MRTF-A上解離下來，促進MRTF-A向細胞核轉移，與SRF結合共同調控SRF依賴的基因轉錄，在Myocardin介導的。上述研究資料提示，MRTF-A在Myocardin介導的心肌細胞的生長、發(fā)育及凋亡過程中有重要作用。因此，深入研究MRTF-A在心肌缺血發(fā)病過程中的作用，不僅有助于進一步揭示其作用機制，同時也可為臨床治療提供科學依據(jù)。

細胞凋亡的變化具有形態(tài)學特征性，熒光標記的TdT介導dUTP缺口末端標記（TUNEL）法觀察凋亡細胞核被認為是定性檢測細胞凋亡的經典方法，它具有敏感度高、特異度強、可量化凋亡程度的特點。本研究結果顯示，在缺血區(qū)心肌組織中可見較多TUNEL陽性反應細胞，與假手術組比較,TUNEL陽性細胞明顯增多。此結果說明，大鼠心肌缺血再灌注損傷的模型構建成功。在此基礎上，運用免疫組化法檢測缺血再灌注損傷區(qū)域的MRTF-A蛋白表達，結果發(fā)現(xiàn)在假手術組的心肌組織中，胞漿內可見少量陽性染色區(qū)域。在缺血再灌注模型組，有大量胞漿染色呈棕黃色，MRTF-A蛋白表達為強陽性。提示MRTF-A可能參與了心肌缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡的過程。那么，MRTF-A作為轉錄調節(jié)因子是是否能影響缺血缺氧所誘導的原代心肌細胞凋亡，其機制如何？

bc1-2家族是細胞凋亡重要的調控蛋白，包括凋亡抑制蛋白bc1-2、促凋亡蛋白Bax及含BH3的結構域蛋白。其中，bc1-2主要定位于線粒體膜及內質網膜，保護膜的穩(wěn)定性，抑制細胞色素C釋放，使其無法達到激活凋亡關鍵蛋白酶Caspase的閾值，阻止細胞凋亡。本研究首先在體外培養(yǎng)的原代心肌細胞上，轉染MRTF-A表達質?；蚬厕D染MRTF-A和MRTF-A siRNA，用缺氧缺血誘導細胞凋亡，用FCM法觀察MRTF-A對缺氧缺血誘導細胞凋亡的影響。結果表明，缺氧缺血能明顯誘導原代心肌細胞凋亡，而轉染MRTF-A表達質粒，即當細胞過表達MRTF-A時，能明顯抑制缺氧缺血誘導的原代心肌細胞的凋亡，而MRTF-A siRNA能逆轉該效應。該結果表明，轉錄調節(jié)因子MRTF-A能明顯抑制缺氧缺血誘導的原代心肌細胞的凋亡。

以此同時，在原代心肌細胞上，轉染MRTF-A表達質?；蚬厕D染MRTF-A和MRTF-A siRNA質粒，用缺氧缺血處理細胞，誘導其凋亡，觀察在缺氧缺血誘導的原代心肌細胞凋亡過程中，MRTF-A對bc1-2表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)：在缺氧缺血誘導的原代心肌細胞凋亡的過程中，轉染MRTF-A表達質粒能明顯上調bc1-2的表達，與其對細胞凋亡的抑制作用呈現(xiàn)相關性。那么MRTF-A是否可影響bc1-2的轉錄活性？為此，本研究構建了啟動子含的bc1-2報告基因質粒及其突變體質粒并轉染至原代心肌細胞，觀察MRTF-A對bc1-2轉錄活性的影響。結果顯示，轉染MRTF-A表達質粒能明顯上調bcl-2報告基因的轉錄活性，而報告基因啟動子突變后，則轉染MRTF-A表達質粒對其轉錄活性無明顯影響。

綜上所述，在缺血再灌注大鼠心肌損傷模型上，發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷時，缺血區(qū)組織中MRTF-A的表達明顯升高，推測MRTF-A可能參與了心肌缺血再灌注損傷誘導的心肌細胞凋亡；在體外培養(yǎng)的原代心肌細胞上，發(fā)現(xiàn)轉錄調節(jié)因子MRTF-A能抑制經缺氧缺血誘導的細胞凋亡，其調節(jié)作用可通過上調抗細胞凋亡相關靶基因bc1-2的表達實現(xiàn)，且初步證明其作用部位為靶基因啟動子上的CArG box。

[1]Moens A L,Claeys M J.Myocardial ischemia/reperfusion-injury, a clinical view on a complex pathophysiological process[J].International Journal of Cardiology,2005,100:179-190.

[2]楊銳，王芬珍.在體大鼠心肌缺血再灌注損傷中NF-κBp65與AngⅡ表達的變化[J].心電與循環(huán),2014,33(2):123-126.

[3]Braunwald E,Kloner RA.Myocardialreperfusion:a double-edged sword[J].Clin Invest,1985,76(5):1713-1719.

[4]Yellon D M,Baxter G F.Protecting the ischaemic and reperfused myocardium in acute myocardial infarction:distant dream or near reality[J].Heart,2000,83(4):381-387.

[5]Rickhag M,Teilum M,Wieloch T.Rapid and long-term induction of effector immediate early genes(BDNF,Neuritin and ARC) in peri-infarct cortex and dentate gyrus after ischemic injury in rat brain[J].Brain Res,2007,1151:203-210.

[6]Joseph M.Miano.Serum response factor:toggling between disparate programs of gene expression[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2003,35:577-593.

[7]Messenguy F,Dubois E.Role of MADS box proteins and their cofactors in combinatorial control of gene expression and cell development[J].Gene,2003,316:1-21.

（本文編輯：馬雯娜）

《浙江醫(yī)學》對計量單位的要求

本刊執(zhí)行GB 3100～3102-1993《量和單位》中有關量、單位和符號的規(guī)定及其書寫規(guī)則，具體執(zhí)行可參照中華醫(yī)學會雜志社編寫的《法定計量單位在醫(yī)學上的應用》。注意單位名稱與單位符號不可混用。組合單位符號中表示相除的斜線多于1條時應采用負數(shù)冪的形式表示，組合單位中斜線和負數(shù)冪亦不可混用，如ng/kg/min應采用ng·kg-1·min-1的形式，不宜采用ng/kg-1·min-1的形式。在敘述中應先列出法定計量單位數(shù)值，括號內寫舊制單位數(shù)值；如果同一計量單位反復出現(xiàn)，可在首次出現(xiàn)時注出法定與舊制單位換算系數(shù)，然后只列法定計量單位數(shù)值。量的符號一律用斜體字，如吸光度（舊稱光密度）的符號“A”。血壓仍以mmHg表示。

本刊編輯部

Protection effect of Myocardin-related transcription factor-A on myocardial survival via inhibiting apoptosis

ZHONG Ze,HU Jiaqing, HU Xinyang,et al.
Department of Cardiology，Jiande First People′s Hospital,Jiande 311600,China

2014-04-17）

浙江省重大科技專項計劃項目（2012C13013-1）、浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2012KYA149）

311600 建德市第一人民醫(yī)院心內科（鐘澤、胡家慶、吳新東、相鵬）；浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院心內科（胡新央、蔣峻）

鐘澤，E-mail：hzzhongze@163.com