徐玲娟 葉璐璐 陳阿瓊 黃茜茜 章慧娣 陳朝生 薛向陽

miR-29a在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血漿中的表達(dá)及意義

徐玲娟 葉璐璐 陳阿瓊 黃茜茜 章慧娣 陳朝生 薛向陽

目的鉬分析microRNA-29a（miR-29a）在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者血漿中的表達(dá)水平及與SLE臨床特征的相關(guān)性。 方法 建立檢測miR-29a的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）方法，分析48例SLE患者和20例健康體檢者血漿中miR-29a的表達(dá)水平，ROC曲線評估其作為SLE診斷標(biāo)記物的意義，統(tǒng)計(jì)分析其表達(dá)與SLE患者臨床特征的相關(guān)性。 結(jié)果 與健康體檢者比較，SLE患者血漿miR-29a表達(dá)水平明顯上調(diào)（Z=3.476，P=0.0009）；血清miR-29a診斷SLE的ROC AUC為0.794（95%CI: 0.689～0.898），具較好診斷SLE的效能；抗β2GP1抗體＞20RU/ml患者的血漿miR-29a水平明顯升高（P=0.033），Pearson相關(guān)分析顯示，SLE患者血漿miR-29a表達(dá)水平與抗β2GP1抗體水平呈正相關(guān)（r=0.584，P=0.001），而與不同SLEDAI評分及其他SLE活動相關(guān)指標(biāo)等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。 結(jié)論 miR-29a在SLE患者血漿中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且血漿miR-29a上調(diào)與SLE患者自身抗體水平相關(guān)，其調(diào)節(jié)機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡 臨床診斷 微小RNA miR-29a

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種常見、累及多系統(tǒng)的自身免疫性疾病。microRNA（miRNA）是一類長度約為19～23個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過互補(bǔ)配對在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其特定靶基因的表達(dá)[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，血漿（血清）、唾液、尿液、乳汁等細(xì)胞外體液中也存在miRNAs[2-4]。其中一些血漿（血清）miRNA被證明可用于腫瘤、心血管疾病、糖尿病等多種疾病的生物標(biāo)志物[5-8]。筆者前期采用miRNA芯片分析SLE患者miRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與正常對照者比較，SLE患者血漿中miR-29家族成員的miR-29a表達(dá)明顯升高。有研究顯示，miR-29家族可調(diào)節(jié)T、B細(xì)胞的發(fā)育及功能，是一種強(qiáng)有力的免疫調(diào)節(jié)劑[9-11]。本研究進(jìn)一步通過定量PCR檢測SLE患者血漿miR-29a的表達(dá)水平，探討其與SLE臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2011年3月至2013年9月由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬金華市中醫(yī)醫(yī)院腎病風(fēng)濕免疫科收治的SLE患者48例，其中男5例，女43例，年齡20～65歲，中位年齡35歲。所有患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1997年修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，采用SLE病情活動評分（SLEDAI評分）評估疾病活動度。選取同期浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬金華市中醫(yī)醫(yī)院健康體檢者20例作為健康對照組，其中男3例，女17例，年齡18～56歲，中位年齡32歲。排除心血管、腫瘤以及其他自身免疫性疾病。兩組性別、年齡比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

1.2 主要試劑 Tri-Reagent BD試劑購自美國Sigma公司，ReverTra Ace qPCR RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Master Mix定量PCR試劑購自日本Toyobo公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水購自寶生物工程（大連）有限公司，其他試劑均為分析純，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集及保存 取EDTA抗凝的外周血，4℃，3 000r/min離心10min，收集血漿，進(jìn)一步去除殘留的細(xì)胞碎片，4℃，12 000r/min離心10min。血漿標(biāo)本置-80℃冰箱保存。

1.3.2 血漿 RNA抽提 按Tri-Reagent BD試劑說明書步驟抽提血漿RNA。為增加RNA得率，在抽提時(shí)加入1μl糖元損失，并采用80%乙醇洗滌RNA沉淀。以DEPC處理水溶解RNA，-80℃保存。為消除血漿RNA抽提的誤差，每份標(biāo)本均取200μl，而且抽提前加入1μl與人miRNAs無同源性的cel-miR-39外參照。

1.3.3 miR-29a表達(dá)的檢測 按照ReverTra Ace qPCR RT Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以5μl血漿RNA以miR-29a莖環(huán)RT引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。莖環(huán)RT引物序列為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGTATTCGCACTGGATACGACTAACCGAT-3′。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為16℃退火30min，42℃延伸30min，98℃5min終止反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存。以20μl反應(yīng)體系進(jìn)行定量PCR檢測miR-29a表達(dá)，PCR反應(yīng)體系含：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μl，0.5μmol/ L miR-29a特異性正向引物，0.5μmol/L miR-29a特異性反向引物，SYBR Master Mix-Plus 10μl，Plus solution 2μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min后，95℃變性15s，60℃退火、延伸1min，循環(huán)40次。miR-29a特異正向引物序列為5′-ATGGTTCGTGGGTAGCACCATCTGAAAT-3′，特異反向引物為5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。外參照cel-miR-39的檢測按照QIAGEN公司熒光定量PCR檢測試劑盒進(jìn)行，每個(gè)樣品有3個(gè)復(fù)孔。采用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行檢測，記錄每個(gè)孔中熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)（Ct值）。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值，以cel-miR-39作為外參照，采用定量PCR中的相對定量法，以N=2-△Ct表示標(biāo)本中miR-29a相對表達(dá)量，其中△Ct=CtmiR-29a-Ctcel-miR-39。為方便數(shù)據(jù)計(jì)算，所有數(shù)值均放大10 000倍。PCR產(chǎn)物采用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以中位數(shù)及四分位間距表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。采用ROC曲線分析miR-29a檢測結(jié)果診斷SLE的靈敏度和特異度，miR-29a表達(dá)水平與抗β2GP1抗體水平的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 血漿miR-29a檢測的特異性分析 miR-29a定量PCR特異度分析見圖1。miR-29a定量PCR的溶解曲線為單峰，其PCR產(chǎn)物經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳顯示為單一條帶，而未逆轉(zhuǎn)錄的RNA對照及空白對照均無擴(kuò)增產(chǎn)物，說明建立的定量PCR體系可以特異檢測血漿標(biāo)本中miR-29a。

圖1 miR-29a定量PCR特異度分析（A：4%瓊脂糖凝膠電泳miR-29a PCR產(chǎn)物的結(jié)果；B：miR-29a定量PCR的溶解曲線）

2.2 SLE患者血漿miR-29a水平的表達(dá) SLE患者及健康對照組血漿中miR-29a表達(dá)水平為分別10.40（6.09，17.86）和4.07（3.60，6.02），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=3.476，P=0.0009），詳見圖2。血清miR-29a診斷SLE的ROC AUC為0.794（95%CI:0.689～0.898），以1.0255作為診斷閾值，其靈敏度為0.755，特異度為0.75，詳見圖3。

圖2 SLE患者和健康對照組血漿miR-29a表達(dá)水平的比較

圖3 SLE患者血漿miR-29a診斷的ROC曲線

圖4 SLE患者血漿miR-29a表達(dá)與抗β2GP1抗體水平關(guān)系散點(diǎn)圖

2.3 SLE患者血漿miR-29a表達(dá)水平與SLE常見臨床特征的相關(guān)性 不同外周血中血小板、抗β2GP1抗體水平SLE患者血漿miR-29a表達(dá)水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而不同年齡、性別、ALT、AST等肝損害相關(guān)指標(biāo)，血尿、蛋白尿等腎功能相關(guān)指標(biāo)及CRP、C3、SLEDAI評分等SLE活動程度臨床指標(biāo)SLE患者血漿miR-29a表達(dá)水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見表1。Pearson相關(guān)分析顯示，SLE患者血漿miR-29a表達(dá)水平與循環(huán)中抗β2GP1抗體水平呈正相關(guān)（r=0.584，P=0.001），詳見圖4。

3 討論

作為細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的重要調(diào)節(jié)者，miRNA已被證實(shí)參與了免疫細(xì)胞的分化、功能及各種自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展過程[12]。細(xì)胞外游離的miRNA作為疾病標(biāo)志物是近年來研究的熱點(diǎn)。許多血漿miRNA已被證實(shí)是癌癥、心血管疾病等多種疾病的生物標(biāo)志[6-7,13]。但關(guān)于血漿（血清）miRNA與SLE相關(guān)性僅少數(shù)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)了血清中miR-200家族、miR-205、miR-192、miR-146a、miR-142-3p、miR-126、miR-125a-3p、miR-155、miRNA-142-3p、miR-181a、miR-106a、miR-17、miR-20a、miR-203、miR-92a、miR-342-3p、miR-223及miR-20a等表達(dá)及作為SLE生物標(biāo)記的可能[14-17]。由于標(biāo)本來源及檢測手段不同，不同研究者得到的結(jié)果也不盡相同。

miR-29a屬于miR-29家族中的一員，人類miR-29家族還包括miR-29b和miR-29c。許多研究已經(jīng)證實(shí)[18-21]，下調(diào)表達(dá)的miR-29a在多種腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。在急性髓細(xì)胞白血病的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-29a表達(dá)水平越低，其復(fù)發(fā)緩解時(shí)間越短，預(yù)后越差[22]。已經(jīng)證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-29a可通過作用于磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN），刺激血管生長[23]；此外，miR-29a通過調(diào)節(jié)靶基因Ⅰ型膠原mRNA，同時(shí)能降低成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致過多的膠原生成[24]。另外，已經(jīng)證明，miR-29可調(diào)控IFN-γ[11]、B7-H3共刺激分子[25]、緩激肽受體2（BDKR2）、CCL8、緊密連接蛋白1（CLDN-1），吲哚胺雙加氧酶（IDO）、IL-2受體α鏈（IL-2RA）、IL-12p40等[26]重要免疫調(diào)節(jié)分子的表達(dá)。近期Qin等[27]在SLE的CD4+T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)與miR-29a同家族的miR-29b表達(dá)水平上調(diào)，并通過抑制DNMT1的表達(dá)，從而使CD4+T細(xì)胞中DNA低甲基化。有研究證實(shí)，在狼瘡活動患者的T細(xì)胞中呈現(xiàn)出DNA甲基化全面減少，而且T細(xì)胞中的甲基化水平與狼瘡疾病活動有關(guān)[28-30]。本研究通過定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，SLE患者血漿中的miR-29a表達(dá)水平明顯上調(diào)，但未發(fā)現(xiàn)miR-29a與SLE疾病活動度有相關(guān)性。

表1 SLE患者血漿miR-29a表達(dá)水平與SLE常見臨床特征的相關(guān)性

在對臨床相關(guān)性資料作進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，抗組蛋白抗體及抗β2GP1抗體＞20RU/ml患者血漿miR-29a水平明顯升高，且miR-29a的表達(dá)水平與循環(huán)中抗β2GP1抗體水平呈正相關(guān)。已經(jīng)明確，B細(xì)胞過度活化增殖產(chǎn)生多種自身抗體（尤其是抗核抗體）不但是SLE活動的重要指標(biāo)，而且是SLE發(fā)病機(jī)制的中心環(huán)節(jié)。這些結(jié)果提示血漿miR-29a可能和SLE患者自身反應(yīng)性B細(xì)胞的功能有關(guān)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，血漿中miR-29a的表達(dá)水平與SLE患者血小板數(shù)量有關(guān)，提示檢測miR-29a對臨床判斷SLE繼發(fā)血小板減少有一定價(jià)值。

綜上所述，SLE患者血漿miR-29a表達(dá)水平上調(diào)可能與自身抗體產(chǎn)生及血液系統(tǒng)損害相關(guān)，為SLE患者病情臨床評價(jià)及干預(yù)治療提供了一條新的線索，其調(diào)節(jié)機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

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Expression of miR-29a in plasma of patients with systemic lupus erythematosus and its clinical significance

XU Linjuan,YE Lulu，CHEN Aqiong,et al.Department of Clinical Laboratory,Affiliated Jinhua TCM Hospital,Zhejiang Chinese Medical University, Jinhua 321017,China

Objective To investigate the expression of microRNA-29a(miR-29a)in plasma of patients with systemic lupus erythematosus(SLE)and its clinical significance. Methods The expression of plasma miR-29a was detected with real-time quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR）in 48 SLE patients and 20 healthy subjects.The value of miR-29a for diagnosis of SLE was assessed by the receiver operating characteristic (ROC)curve.The relationship between the plasma miR-29a levels and clinical characteristics was analyzed. Results Compared with the healthy controls,the expression of miR-29a in plasma of patients with SLE was significantly higher(Z=3.476,P=0.0009).The area under the curve(AUC)of ROC was 0.794(95%CI: 0.689-0.898).Patients with positive anti-β2GP1 antibody showed higher miR-29a levels in plasma than those with negative anti-β2GP1 antibody(P=0.033).In addition,Pearson analysis indicated that the plasma level of miR-29a was positively correlated with the level of anti-β2GP1 antibodies(r=0.584,P=0.001).However,the SLEDAI score and other clinical indicators of SLE activation were not significantly correlated with the plasma level of miR-29a. Conclusion The expression of miR-29a in the plasma of SLE patients is up-regulated,which were associated with the levels of several auto-antibodies.

Systemic lupus erythematosus Clinical diagnosis MicroRNA MiR-29a

2015-02-06）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省科技廳科研基金資助項(xiàng)目（2012C33126）；浙江省大學(xué)生新苗計(jì)劃（2015R413027）；金華市科技局科研基金資助項(xiàng)目（2013-3-014）

321017 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬金華市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科（徐玲娟）；溫州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)教研室，分子病毒與疫苗研究所，熱帶醫(yī)學(xué)研究所（葉璐璐、黃茜茜、薛向陽）；寧波李惠利醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（陳阿瓊）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科（章慧娣、陳朝生）

薛向陽，E-mail：wyxyy001@163.com