余曉燕 陸啟光 姚楊偉

●論 著

維生素D和維生素D結合蛋白在非小細胞肺癌患者中的表達及其對預后的影響

余曉燕 陸啟光 姚楊偉

目的 探討維生素D和維生素D結合蛋白（DBP）在非小細胞肺癌（NSCLC）患者中的表達及其對預后的影響。方法 選取74例NSCLC患者，采用ELISA法檢測患者血清中25（OH）D和DBP的濃度。分析其與患者臨床病理特征（包括性別、年齡、腫塊大小、淋巴結轉移情況、分化程度、組織學類型以及病理分期）及預后的關系。以NSCLC患者的癌旁正常肺組織作為對照，用Western blot檢測患者肺癌組織中DBP的表達情況。結果 與癌旁正常肺組織比較，DBP在NSCLC組織中表達下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。血清中維生素D和DBP濃度與患者年齡、淋巴結轉移及病理分期相關（P＜0.05或0.01）。依據維生素D濃度將患者分為A組[25（OH）D＜25ng/ml]、B組[25ng/ml≤25（OH）D＜40ng/ml]、C組[25（OH）D≥40ng/ml]，依據DBP濃度將患者分為a組（DBP＜20mg/dl）、b組（20mg/dl≤DBP＜40mg/dl）、c組（DBP≥40mg/dl），隨著兩者濃度增高，患者生存曲線依次上移。Cox比例風險回歸模型分析顯示，維生素D和DBP的高表達是患者預后的保護因素（均P＜0.05）。結論 血清中維生素D和DBP濃度高低在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要意義，兩者可作為NSCLC患者預后評估的輔助指標。

維生素D 維生素D結合蛋白 非小細胞肺癌 預后

【 Abstract】 Objective To determine serum vitamin D(VD)and vitamin D-binding protein(DBP)levels in non-small cell lung cancer(NSCLC)and its association with the survival of patients. Methods Seventy four NSCLC patients undergoing surgical treatment were included in the study.The serum VD and DBP levels were measured with ELISA and the expression of VD and DBP in lung cancer tissue were detected with Western blot.The association of VD and DBP expression with the cliniopathological parameters and survival of patients was analyzed. Results Serum VD and DBP levels were correlated with pathological stage,lymph node metastasis and ages of patients(P＜0.05 or 0.01).And serum VD and DBP levels were positively correlated with survival of patients.Multivariate analysis revealed that serum VD and DBP level was an independent prognostic indicator for overall survival of patients(both P＜0.05).Compared with corresponding normal lung tissue,the expression of VD and DBP in lung cancer tissue was down-regulated(P＜0.01). Conclusion VD and DBP expression in serum and cancer tissue are decreased in patients with NSCLC,and VD and DBP levels may be used for predicting survival of NSCLC patients.

肺癌是目前全球范圍內病死率最高的惡性腫瘤，每年新增病例達120萬例，其中最常見的病理類型為非小細胞肺癌（non－small cell lung cancer，NSCLC）[1]，約占80%。維生素D是一種脂溶性維生素，其在循環(huán)系統(tǒng)的主要存在形式為25（OH）D，研究發(fā)現(xiàn)其不僅在鈣磷代謝方面發(fā)揮作用，而且能夠抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和血管新生，并能促進腫瘤細胞凋亡[2]。維生素D結合蛋白（vitamin D－binding protein，DBP）是一種相對分子量為51 000～58 000的多功能血漿球蛋白，主要合成于肝臟，參與維生素D及其代謝產物的轉運和代謝，并在肌動蛋白、內毒素和異常細胞的清除過程中起到了重要作用[3]。多項研究發(fā)現(xiàn)血清中維生素D濃度與NSCLC患者的存活時間相關[4]。本研究旨在通過測定血清中維生素D和DBP濃度以及組織中DBP的表達，探究維生素D和DBP在NSCLC診治中的臨床意義。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2006年8至11月在嘉興第二醫(yī)院手術的74例NSCLC患者為研究對象，其中男54例，女20例，年齡33～77歲，平均（64.12±6.43）歲。所有患者均于入院后第2天采集血液標本并于術后留取腫瘤組織標本，以離腫瘤邊緣5cm以上且病理證實無癌細胞浸潤的癌旁正常肺組織作為對照。采集的血清和組織標本均儲存于－80℃的低溫冰箱中。對患者采用電話隨訪及門診復診的方式，隨訪截止時間為2011年8月30日。74例患者中有6例失訪，其中5例聯(lián)系中斷，1例不愿接受隨訪。總生存時間定義為從手術之日至任何原因引起的死亡或者隨訪的終點。

1.2 試劑和儀器 DBP和25（OH）D檢測ELISA試劑盒均購于德國Immundia公司，抗DBP抗體、抗β－actin抗體以及多克隆羊抗鼠二抗為英國Abcam公司產品，免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，電泳儀及附件、轉膜儀及附件均為美國BIO－RAD公司產品。

1.3 方法

1.3.1 血清DBP和25（OH）D濃度測定 所有患者均于入院后第2天空腹抽取靜脈血4ml，室溫放置2h后1 000g/min離心20min分離血清，以ELISA間接法檢測血清DBP和25（OH）D蛋白濃度，分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔，酶標儀450nm波長下測量各孔的光密度（OD值）。

1.3.2 Western blot檢測肺組織DBP表達 從保存的組織中提取蛋白，Lowry法測定蛋白濃度。上樣檢測，化學發(fā)光試劑顯色，膠片貼近曝光，顯影、定影后采用Image J圖像分析軟件進行定量分析。蛋白相對表達量以與內參照β－actin的表達之比表示。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，自身對照比較采用配對t檢驗，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan－Meier法繪制生存曲線，維生素D和DBP的濃度與患者預后的關系采用Cox比例風險回歸模型進行分析。

2 結果

2.1 NSCLC患者肺組織DBP表達情況 Western blot結果提示，DBP在NSCLC組織中的相對表達量（DBP/ β－actin）為0.046±0.013，而癌旁正常肺組織中的相對表達量為2.850±0.230，兩者比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），見圖1。

圖1 NSCLC患者肺組織DBP表達情況（T：腫瘤組織；N：癌旁正常肺組織；數字代表隨機抽取樣本標記）

2.2 血清中DBP和25（OH）D濃度與患者臨床病理特征的關系 見表1。

表1 血清中DBP和25(OH)D濃度與患者臨床病理特征的關系

由表1可見，不同性別、組織學類型、腫瘤大小NSCLC患者的DBP濃度和25（OH）D濃度均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），而在不同年齡、淋巴結轉移、病理分期的患者間DBP濃度和25（OH）D濃度均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或0.01）。

2.3 影響NSCLC患者預后的因素 Cox比例風險回歸模型提示，性別、腫瘤大小、組織學類型不是NSCLC患者預后的影響因素（均P＞0.05），而年齡、淋巴結轉移、病理分期、DBP濃度和25（OH）D濃度是NSCLC患者預后的影響因素（P＜0.05或0.01），見表2。

2.4 血清中維生素D和DBP濃度與NSCLC患者預后的關系 根據DBP濃度將患者分為a組（DBP＜20mg/ dl）、b組（20mg/dl≤DBP＜40mg/dl）、c組（DBP≥40mg/dl），根據25（OH）D濃度將患者分為A組[25（OH）D＜25ng/ml]、B組[25ng/ml≤25（OH）D＜40ng/ml]、C組[25（OH）D≥40ng/ml]。Cox比例風險回歸模型分析顯示，DBP和25（OH）D的高表達是預后的保護因素（均P＜0.05），各組患者生存曲線見圖2-3。

表2 影響NSCLC患者預后的因素

圖2 不同DBP濃度患者的生存曲線

圖3 不同25（OH）D濃度患者的生存曲線

3 討論

DBP是血液中維生素D的主要轉運蛋白，大約88%的維生素D由DBP轉運。DBP除了作為循環(huán)系統(tǒng)中維生素D的轉運體，還有著多種生物學功能。它能夠結合并清除細胞外肌動蛋白，以及從受損組織和死亡細胞中釋放的球狀肌動蛋白，從而避免循環(huán)系統(tǒng)中肌動蛋白堵塞血管[3]。DBP也參與免疫應答，在去糖基化酶的作用下能夠轉換成巨噬細胞激活因子，從而具有抗血管新生和抗腫瘤的作用[5]。在炎癥反應中DBP還能夠促進中性粒細胞的趨化[6]。α-生育酚、β-胡蘿卜素癌癥預防研究中發(fā)現(xiàn)，血清中的DBP能夠影響維生素D相關的胰腺癌[4]、前列腺癌[7]和膀胱癌[8]的患病率，同時對腎細胞癌的患病率也有影響[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者癌組織中的DBP表達相對癌旁正常肺組織明顯減少，血清中DBP的高表達是患者預后的保護因素，這一結果也證實了DBP的作用。DBP的作用機制可能與以下兩方面有關：一方面通過結合維生素D起到抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和血管新生的作用，同時促進腫瘤細胞凋亡；另一方面通過轉化為巨噬細胞激活因子激活巨噬細胞，促進中性粒細胞趨化作用，提高機體免疫功能，清除腫瘤細胞。本研究還發(fā)現(xiàn)NSCLC患者中血清中維生素D和DBP濃度受到患者年齡、淋巴結轉移及腫瘤病理分期的影響。患者血清中維生素D濃度隨患者年齡增大而降低，可能與老年患者維生素D補充及攝入不足有關，而DBP含量降低可能與老年人的免疫功能相對減弱有關。

Tretli等[10]在一個納入210例肺癌患者的臨床研究中報道血清中高濃度維生素D能夠延長患者生存時間。Zhou等[11]研究發(fā)現(xiàn)那些血清維生素D濃度高的NSCLC患者生存時間較長。本研究結果同樣也提示患者血清中維生素D高表達的NSCLC患者生存曲線上移，維生素D高表達是患者預后的保護因素。

總之，血清中維生素D和DBP濃度高低在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要意義，兩者可作為NSCLC的預后評估的輔助指標。

[1]Anic G M,Weinstein S J,MondulAM,et al.Serum vitamin D,vitamin D binding protein,and lung cancer survival[J].Lung Cancer, 2014,86(3):297-303.

[2] Giovannucci E.The epidemiology of vitamin D and cancer incidence and mortality:a review (United States)[J].Cancer Causes Control,2005,16(2):83-95.

[3] Chun R F.New perspectives on the vitamin D binding protein[J]. CellBiochem Funct,2012,30(6):445-456.

[4] Weinstein S J,Stolzenberg-Solomon R Z,Kopp W,et al.Impact of circulating vitamin D binding protein levels on the association be-tween 25-hydroxyvitamin D and pancreatic cancer risk:a nested case-controlstudy[J].Cancer Res,2012,72(5):1190-1198.

[5] Yamamoto N,Homma S.Vitamin D3 binding protein(group-specific component)is a precursor for the macrophage-activating signal factor from lysophosphatidylcholine-treated lymphocytes [J].Pro NatlAcad SciU S A,1991,88(19):8539-8543.

[6] Nagasawa H,Uto Y,SasakiH,et al.Gc protein(vitamin D-binding protein):Gc genotyping and GcMAF precursor activity[J].Anticancer Res,2005,25(6A):3689-3695.

[7] Weinstein S J,MondulAM,Kopp W,et al.Circulating 25-hydroxyvitamin D,vitamin D-binding protein and risk of prostate cancer [J].Int J Cancer,2013,132(12):2940-2947.

[8] MondulA M,Weinstein S J,Virtamo J,et al.Influence of vitamin D binding protein on the association between circulating vitamin D and riskofbladdercancer[J].BrJ Cancer,2012,107(9):1589-1594.

[9] Mondul A M,Weinstein S J,Moy K A,et al.Vitamin D-binding protein,circulating vitamin D and risk ofrenalcellcarcinoma[J].Int J Cancer,2014,134(11):2699-2706.

[10] Tretli S,Schwartz G G,Torjesen P A,et al.Serum levels of 25-hydroxyvitamin D and survival in Norwegian patients with cancer of breast,colon,lung,and lymphoma:a population-based study[J].CancerCauses Control,2012,23(2):363-370.

[11] Zhou W,Heist R S,Liu G,et al.Circulating 25-hydroxyvitamin D levels predict survival in early-stage non-small-cell lung cancer patients[J].J Clin Oncol,2007,25(5):479-485.

Serum vitamin D and vitamin D-binding protein levels in non-small cell lung cancer and its association with prognosis of pa-tients

YU Xiaoyan,LU Qiguang,YAO Yangwei.
Department of Respiratory Medicine,the Second Hospital of Jiaxing,Jiaxing 314000,China

Vitamin D Vitamin D-binding protein Non-small cell lung cancer Prognosis

2014-12-11）

（本文編輯：胥昀）

本刊可直接用縮寫的常用詞匯

314000 嘉興市第二醫(yī)院呼吸科

姚楊偉，E-mail：yuyf_2000@163.com