李利義 羅越 劉海斌 韓紹偉 王飛海 鄭志強(qiáng)

CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及意義

李利義 羅越 劉海斌 韓紹偉 王飛海 鄭志強(qiáng)

目的 探討趨化性細(xì)胞受體因子4（CXCR4）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（VEGF-C）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及意義。方法 應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)76例人胃癌組織中CXCR4、VEGF-C和MMP-9的表達(dá)水平，并分析其與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果 CXCR4、VEGF-C或MMP-9任一指標(biāo)表達(dá)水平與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著關(guān)系（均P＜0.01），且這3項(xiàng)指標(biāo)兩兩相關(guān)，CXCR4/VEGF-C聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為84.8%（28/33），高于僅1項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)（11/22，50.0%）及兩者聯(lián)合陰性表達(dá)（7/21，33.3%）的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；VEGF-C/MMP-9聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為80.0%（32/40），高于僅1項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)（9/19，47.4%）及兩者聯(lián)合陰性表達(dá)（5/17，29.4%）的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；CXCR4/MMP-9聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為83.3%（30/36），高于僅1項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)（11/22，50.0%）及兩者聯(lián)合陰性表達(dá)（5/18，27.8%）的患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。3項(xiàng)指標(biāo)共同表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高達(dá)90.0%。結(jié)論 CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌組織中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，如果3項(xiàng)指標(biāo)均為陽(yáng)性者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性最大。

趨化性細(xì)胞受體因子4 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C 質(zhì)金屬蛋白酶-9 胃癌 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

胃癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤，居人類(lèi)腫瘤相關(guān)致死率第2位[1]。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡最主要的原因，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移方式，有研究證實(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。趨化性細(xì)胞受體因子4（chemokine CXC receptor 4，CXCR4）及其配體CXCLl2所構(gòu)成的信號(hào)傳導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)血細(xì)胞產(chǎn)生、造血細(xì)胞遷移及新生血管形成方面發(fā)揮了重要作用，與腫瘤特異性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-5]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）可以促進(jìn)新生血管形成，而且可以促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化并誘導(dǎo)淋巴管生成?；|(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一種能降解細(xì)胞外基底膜及其它細(xì)胞外基質(zhì)成分的重要蛋白酶，具有促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的作用。為此，本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)人胃癌組織中CXCR4、VEGF-C和MMP-9的表達(dá)水平，分析CXCR4、VEGF-C和MMP-9與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討它們?cè)谖赴┝馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移中的作用，以及三者表達(dá)的相關(guān)性和臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2009年12月至2010年12月在我院外科行手術(shù)治療的76例胃癌患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本；患者中男52例，女24例，年齡26～79歲，中位年齡60歲；所有患者術(shù)前均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)，均未接受放療或化療。腫瘤分期采用2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟頒布的胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。每例患者于術(shù)后10min內(nèi)取組織標(biāo)本，包括腫瘤組織及正常胃黏膜組織（距腫瘤組織邊緣5cm以上），并迅速置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 兔抗人VEGF-C試劑盒為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，鼠抗人CXCR4抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，兔抗人MMP-9抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司，免疫組化S-P試劑盒購(gòu)自德國(guó)寶靈曼公司。

1.3 方法 采用S-P法進(jìn)行免疫組化染色。所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后制備5μm厚連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟，以微波枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明封片，顯微鏡下觀察，操作過(guò)程中嚴(yán)格質(zhì)控。用已知的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 在組織切片中CXCR4、VEGF-C和MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)或(和)細(xì)胞膜染為棕黃色。免疫染色的結(jié)果由病理科醫(yī)生判定，每個(gè)樣本采用雙盲法計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野，評(píng)估陽(yáng)性細(xì)胞率。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性，≥10%為陽(yáng)性，同時(shí)忽略較弱或可疑的染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4、VEGF-C或MMP-9單一表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 76例胃癌患者中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌組織中免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)見(jiàn)圖1。CXCR4、VEGFC或MMP-9表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系見(jiàn)表1。

圖1 CXCR4（a）、VEGF-C（b）或MMP-9（c）在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

表1 CXCR4、VEGF-C或MMP-9表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[例（%）]

由表1可見(jiàn)，在CXCR4、VEGF-C或MMP-9陽(yáng)性表達(dá)的患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯高于陰性表達(dá)的患者（均P＜0.01），說(shuō)明CXCR4、VEGF-C或MMP-9陽(yáng)性表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.2 CXCR4、VEGF-C和MMP-9聯(lián)合表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn)，CXCR4和VEGF-C均陽(yáng)性表達(dá)的患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯高于該2項(xiàng)指標(biāo)均陰性表達(dá)的患者；與僅有1項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)的患者相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率也明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。同樣，VEGF-C和MMP-9或CXCR4和MMP-9均陽(yáng)性表達(dá)的患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率均明顯高于該2項(xiàng)指標(biāo)均陰性或僅有1項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)的患者（P＜0.05或0.01）。這一結(jié)果提示，3項(xiàng)指標(biāo)中任意2項(xiàng)陽(yáng)性表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。進(jìn)一步對(duì)CXCR4、VEGF-C和MMP-9這3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合分析，46例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，僅1項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)的患者有5例，2項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)的患者有12例，3項(xiàng)指標(biāo)均陽(yáng)性表達(dá)的患者有27例（90.0℅），3項(xiàng)指標(biāo)均陰性表達(dá)的患者有2例，而在30例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，3項(xiàng)指標(biāo)均陽(yáng)性表達(dá)的患者僅有3例（10.0℅）；3項(xiàng)指標(biāo)均陽(yáng)性表達(dá)的患者其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯高于非3項(xiàng)指標(biāo)均陽(yáng)性表達(dá)的患者（P＜0.01）。以上結(jié)果表明：相比于0、1或2項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)，3項(xiàng)指標(biāo)共同陽(yáng)性表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系更為密切。

表2 CXCR4、VEGF-C和MMP-9聯(lián)合表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[例（%）]

2.3 CXCR4、VEGF-C和MMP-9表達(dá)的相互關(guān)系 相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中CXCR4的陽(yáng)性表達(dá)與VEGF-C、MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)均呈顯著正相關(guān)（r=0.355、0.384，均P＜0.01），VEGF-C的陽(yáng)性表達(dá)與MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)也呈顯著正相關(guān)（r=0.278，P＜0.05）。提示在胃癌的發(fā)展過(guò)程中，CXCR4、VEGF-C和MMP-9的高表達(dá)具有協(xié)同促進(jìn)作用。

3 討論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌最主要的轉(zhuǎn)移途徑，并且是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此，研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，控制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，成為胃癌治療的重要環(huán)節(jié)，也可能為胃癌的藥物治療研究提供新的靶點(diǎn)。

CXCR4信號(hào)通路通過(guò)引導(dǎo)趨化和侵襲反應(yīng)在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到了至關(guān)重要的作用[6]。VEGF-C是腫瘤血管生成的重要調(diào)控因子[7]，并且可以通過(guò)與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體結(jié)合，增加淋巴管的通透性，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增生，誘導(dǎo)淋巴管的生成[8]。MMP-9可以降解腫瘤的細(xì)胞外基質(zhì)，破壞基底膜，促進(jìn)新生血管生成?；啄さ慕到夂托律艿男纬晒餐偈鼓[瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)，通過(guò)CXCR4-CXCLl2生物學(xué)軸的趨化作用，使腫瘤細(xì)胞在靶器官被俘獲，在靶器官再通過(guò)VEGF和MMP-9引起血管新生、基底膜降解，并協(xié)同其他因子最終導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。

本研究通過(guò)免疫組化方法分析了胃癌中CXCR4、VEGF-C和MMP-9的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR4、VEGF-C或MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，聯(lián)合評(píng)估這些標(biāo)記物的表達(dá)可能可以用于預(yù)測(cè)胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

最近的研究證實(shí)：通過(guò)CXCL12刺激趨化因子受體CXCR4表達(dá)或通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系CXCR4過(guò)表達(dá)，可以增加VEGF的異常表達(dá)和新生血管形成[9-10]。趨化因子受體CXCR4與其配體CXCL12相互作用，然后通過(guò)誘導(dǎo)VEGF介導(dǎo)的血管再生可能促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。由此我們推斷：CXCR4和VEGF的表達(dá)水平可能是合適的預(yù)測(cè)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的生物學(xué)指標(biāo)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)胃癌中CXCR4和VEGF-C的表達(dá)具有顯著相關(guān)性。此外，與僅1項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)的患者相比，CXCR4和VEGF-C聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，CXCR4和VEGF-C表達(dá)的變化可能在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。

由CXCL12-CXCR4軸介導(dǎo)的癌細(xì)胞至靶器官的趨化作用需要細(xì)胞遷移通過(guò)基底膜，但CXCL12和CXCR4不能單獨(dú)介導(dǎo)這一過(guò)程。有趣的是，MMP-9在細(xì)胞外基質(zhì)降解及促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移通過(guò)基底膜的過(guò)程中能發(fā)揮重要的作用[11]。體外試驗(yàn)表明：CXCL12-CXCR4相互作用可以增加多種腫瘤細(xì)胞系MMP-9的分泌，包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌[12-13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CXCR4和MMP-9的表達(dá)顯著相關(guān)，表明CXCR4的異常表達(dá)可能導(dǎo)致胃癌中MMP-9的超表達(dá)。我們還發(fā)現(xiàn)，與單一指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)的患者相比，CXCR4和MMP-9聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著增加。這一證據(jù)表明，CXCR4和MMP-9的聯(lián)合表達(dá)至少在一定程度上可能導(dǎo)致胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但需要更多的研究來(lái)分析CXCR4介導(dǎo)的信號(hào)通路導(dǎo)致MMP-9激活的機(jī)制，以及它們?cè)谖赴┌l(fā)展中的協(xié)同作用。

Sweeney等[143]利用特定抗VEGF抗體治療前列腺癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-9的產(chǎn)生明顯減少，因此我們推斷：MMP-9與VEGF的表達(dá)有內(nèi)在聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，胃癌中VEGF-C和MMP-9的表達(dá)有顯著的相關(guān)性；VEGF-C和MMP-9聯(lián)合陽(yáng)性表達(dá)的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著增加。以上結(jié)果提示VEGF-C和MMP-9在介導(dǎo)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面具有協(xié)同效應(yīng)，其聯(lián)合表達(dá)可能是胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)。

總之，目前的研究表明CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌組織中高度表達(dá)[15]，而且它們的表達(dá)具有顯著相關(guān)性。任一指標(biāo)的獨(dú)立表達(dá)與胃癌進(jìn)展相關(guān)，3項(xiàng)指標(biāo)中的任意2項(xiàng)聯(lián)合表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)；與0、1或2項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)相比，3項(xiàng)指標(biāo)共同表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系更為密切。因此，CXCR4、VEGF-C和MMP-9共同表達(dá)可能是胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有價(jià)值的預(yù)測(cè)指標(biāo)，三者的協(xié)同作用可能促進(jìn)腫瘤血管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，抑制三者的表達(dá)可能是胃癌一種有效的輔助治療方法。

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Correlation of CXCR4,VEGF,MMP-9 expression w ith lymphatic metastasis in gastric cancer

LI Liyi,LUO Yue,LIU Haibin,et al.
Department of General Surgery,the Second Affiliated Hospital ofWenzhou Medical University,Whenzhou 325027,China

Objective To investigated the association of CXCR4,VEGF-C,MMP-9 exp ression with lymphatic metastasis in gastric cancer.Methods The exp ressions of CXCR4,VEGF-C and MMP-9 were detected by immuohistochem istry in 76 samp les of gastric cancer.The relationship between these markers and lymph node metastasis of gastric cancerwas analyzed.Results The exp ression of CXCR4、VEGF-C and MMP-9 was significantly associated with lymph node metastasis in gastric cancer(P＜0.01).The exp ressions of three p roteins were significantcorrelated w ith each other.Rate of lymph nodemetastasis in patients w ith exp ression of both CXCR4 and VEGF-C was 84.5%(28/33),which was significantly higher than that in patients w ith sing le p rotein exp ression(11/22,50.0%)or in those with negative exp ression(7/21,33.3%).Sim ilarly,the rate in patients w ith both VEGF-C and MMP-9 exp ression was 80.0%(32/40),which was higher than that in patients w ith sing le p rotein positive exp ression(9/19,47.4%),or in those w ith negative exp ression(5/17,29.4%).The rate in patients w ith both CXCR4 and MMP-9 exp ression was 83.3%(30/36),which was higher than that in patients w ith sing le p rotein positive exp ression(11/22,50.0%),or in those w ith negative exp ression(5/18,27.8%).The d ifferences were all found to be statistically significant(P＜0.01).The rate of lym ph nodemetastasis in patients w ith exp ression ofall three p roteins was 90.0%(27/30).Conclusion The exp ression of CXCR4, VEGF-C and MMP-9 is c losely correlated w ith lym ph nodemetastasis in gastric cancer,patients w ith positive exp ression of three markers aremost likely to have lym ph nodemetastasis.

CXCR4 VEGF-C MMP-9 Gastric cancer Lym phatic metastasis

2013-06-06）

（本文編輯：沈叔洪）

溫州市科技計(jì)劃基金（Y20090061）

325027溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科