張芬芬，蔣孟虹，孫林林，毛黎順，沈文斌（.中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 0009；.上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 00；.江蘇柯菲平醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，南京 006；4.中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院，南京 0009）

核磁共振氫譜法（1H－NMR）測定西他沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量

張芬芬1，蔣孟虹2，孫林林1，毛黎順3，沈文斌4＊（1.中國藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 210009；2.上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203；3.江蘇柯菲平醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司，南京 210016；4.中國藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院，南京 210009）

目的 建立核磁共振氫譜法測定西他沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對含量。方法 采用Bruker AVANCE－500型和AVANCE－300型儀器，分別以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內(nèi)標(biāo)，西他沙星中質(zhì)子信號在δ8.69，δ7.76，δ3.43和δ3.14，鹽酸吉西他濱質(zhì)子信號在δ8.12，δ6.21和δ6.02，齊多夫定中質(zhì)子信號在δ7.61和δ6.01作為定量峰，0.5mL DMSO－d6∶氚代鹽酸（DCl，44.8 mg·L－1）＝4∶1為溶劑，測定條件為：探頭溫度303K，譜寬11.0，中心頻率4.9，脈沖序列為zg 30°，延遲時(shí)間20s，采樣次數(shù)32次，窗函數(shù)0.3Hz。結(jié)果 在此條件下，樣品與內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱及齊多夫定的定量峰分離良好，進(jìn)樣精密度及重復(fù)性較好，線性范圍寬，樣品與內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱和齊多夫定質(zhì)量比分別在0.354 9～1.343 9和0.312 4～1.189 2范圍內(nèi)，其線性擬合方程分別為：Y＝1.440 9X＋0.017 8（r＝1.000 0，n＝5），Y＝1.634 6X＋0.008 5（r＝0.999 9，n＝5）。結(jié)果西他沙星的含量分別為99.26%（RSD為0.06%）和99.22%（RSD為0.17%）。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、專屬、簡便、快速，適用于該藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對含量測定。

核磁共振氫譜法；西他沙星；含量測定

西他沙星（sitafloxacin，圖1A）是由日本第一制藥三共株式會社研制開發(fā)的一種新喹諾酮類廣譜抗菌藥［1］，其對大多數(shù)革蘭陽性菌、陰性菌具強(qiáng)大的抗菌活性，對其他對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的厭氧菌和非典型致病菌如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌及鏈球菌也有抗菌活性［2］。2008年6月30日，西他沙星正式在日本上市片劑和細(xì)顆粒劑，被批準(zhǔn)用于治療呼吸系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)感染，其開發(fā)前景廣闊。目前，《中國藥典》2010年版、《美國藥典》35版（USP35－NF30）、歐洲藥典7.6版（EP 7.6）及日本藥局方16版（JP 16）均未收載西他沙星的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。作為創(chuàng)新藥，目前報(bào)道較多的是西他沙星的藥理作用［2－4］，其理化性質(zhì)及檢測方法也有報(bào)道［5－8］，如HPLC、LC／MS／MS及毛細(xì)管電泳法。HPLC測定方法準(zhǔn)確、可靠，但需對照品才能完成定量測定［9－10］，LC／MS／MS及毛細(xì)管電泳法操作復(fù)雜。未見文獻(xiàn)報(bào)道用核磁共振技術(shù)對其進(jìn)行含量測定。

定量核磁共振法（quantitative nuclear magnetic resonance，QNMR）基于各化學(xué)環(huán)境中質(zhì)子吸收峰的面積與誘發(fā)的核質(zhì)子數(shù)呈正比，計(jì)算公式簡單，不需特定的對照品，快速準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)及不破壞樣品［1112］，特別適合無對照品的新藥的含量測定。1HNMR檢測靈敏度高，其定量準(zhǔn)確度可達(dá)到或接近HPLC水平［13］，已應(yīng)用于醫(yī)藥［14］、化學(xué)［15］、生物［16］、食品［17］、化工［18］、農(nóng)業(yè)［19］以及軍事［20］等諸領(lǐng)域，該方法現(xiàn)已被收載于《中國藥典》2010年版［21］。本文建立了1H－NMR法，以鹽酸吉西他濱（圖1B）和齊多夫定（圖1C）為內(nèi)標(biāo)，測定西他沙星的絕對含量。研究了溶劑、內(nèi)標(biāo)物、定量峰、核磁共振實(shí)驗(yàn)參數(shù)的選擇對該方法結(jié)果的影響，為該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量測定提供了一種新思路。

圖1 化學(xué)結(jié)構(gòu)（數(shù)字標(biāo)記處為所選定量峰）A.西他沙星；B.鹽酸吉西他濱；C.齊多夫定Fig.1 Chemical structure（marked signals were selected for quantitative analysis）A.sitafloxacin；B.gemcitabine hydrochloride；C.zidovudine

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Bruker AVANCE－500、AVANCE－300型超導(dǎo)核磁共振儀，采用QNP探頭；AB265－S型電子天平（Mettler Toledo公司，感量0.01mg），真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥 西他沙星，由江蘇柯菲平醫(yī)藥有限公司提供（批號101001）；齊多夫定（批號H0F263，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%，USP對照品）；鹽酸吉西他濱（批號G0G083，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%，USP對照品）；氘代二甲亞砜（99.9%氘代，Sigma－Aldrich公司）；氘代鹽酸（99.7%氘代，Sigma－Aldrich公司）；重水（99.9%氘代，Sigma－Aldrich公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取供試品約10 mg，內(nèi)標(biāo)約6.5mg，置于同一離心管內(nèi)，加DMSO－d60.4mL及DCl（44.8mg·L－1）0.1mL，振蕩溶解，渦旋混勻，配制成每毫升分別含樣品及內(nèi)標(biāo)0.04mmol的供試品溶液，轉(zhuǎn)移至5mm標(biāo)準(zhǔn)核磁管內(nèi)，即得。

2.21H－NMR測定條件 采用QNP探頭，掃描寬度（sw）：11.0ppm，中心頻率（O1P）：4.9ppm；脈沖序列：zg 30°；時(shí)間域數(shù)據(jù)點(diǎn)（td）：32K；測定溫度：303 K；延遲時(shí)間（d1）：20s；采樣次數(shù)（ns）：32次；窗函數(shù)（lb）：0.3Hz；每份樣品平行測定5次。

2.3 西他沙星樣品的測定 取干燥后的西他沙星樣品，按2.1項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.2項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，采集并處理圖譜，并按下式計(jì)算樣品含量。

其中：Ix和IIS分別為西他沙星和內(nèi)標(biāo)定量峰積分面積；Nx和NIS分別為西他沙星和內(nèi)標(biāo)定量峰積分信號包含的質(zhì)子數(shù)（Nx＝4，NIS＝3（鹽酸吉西他濱），NIS＝2（齊多夫定））；Mx和MIS分別為西他沙星和內(nèi)標(biāo)的相對分子質(zhì)量；mx和mIS分別為西他沙星和內(nèi)標(biāo)的稱樣量；Px和PIS分別為西他沙星和內(nèi)標(biāo)的含量（%）。測定供試品的結(jié)果如表1和表2所示，以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內(nèi)標(biāo)時(shí)，含量均值分別為99.26%和99.22%，RSD分別為0.06%和0.17%，結(jié)果較一致。

表1 內(nèi)標(biāo)為鹽酸吉西他濱的西他沙星含量測定結(jié)果Tab.1 Results of gemcitabine hydrochloride for the determination of sitafloxacin

表2 內(nèi)標(biāo)為齊多夫定的西他沙星含量測定結(jié)果Tab.2 Results of zidovudine for the determination of sitafloxacin

2.4 專屬性考察 西他沙星樣品、內(nèi)標(biāo)及樣品與內(nèi)標(biāo)混合溶液的核磁共振氫譜如圖2所示。結(jié)果表明，樣品氫譜中的質(zhì)子信號δ8.69，δ7.76，δ3.43和δ3.14可作為定量峰，內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱的定量峰可選δ8.12，δ6.21和δ6.02，齊多夫定的定量峰可選δ7.61和δ6.01，其混合溶液中樣品與內(nèi)標(biāo)各定量峰能夠完全分離，各定量信號無相互干擾。

2.5 線性及范圍 精密稱取約20，15，10，10和10 mg的西他沙星樣品，分別置于離心管中，分別取內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱與齊多夫定約7，7，7，10，13，6，6，6，9和12mg，精密稱定，按2.1項(xiàng)下方法配制5份系列溶液，按2.2項(xiàng)下條件進(jìn)行測定，以內(nèi)標(biāo)與西他沙星的摩爾比X為橫坐標(biāo)，以其定量峰積分面積比值Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y＝1.440 9 X＋0.017 8（r＝1.000 0，n＝5）；Y＝1.634 6 X＋0.008 5（r＝0.999 9，n＝5）。結(jié)果表明，樣品與內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱和齊多夫定質(zhì)量比分別在0.354 9～1.343 9和0.312 4～1.189 2范圍內(nèi)，氫信號與樣品稱樣量成正比，所建立以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內(nèi)標(biāo)的西他沙星核磁共振定量法線性關(guān)系良好。

2.6 進(jìn)樣精密度實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，按2.2項(xiàng)下條件連續(xù)測定6次，記錄積分面積，計(jì)算樣品與內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱和齊多夫定的積分面積比值的RSD（n＝6）分別為0.20%和0.15%。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取相同質(zhì)量濃度的西他沙星樣品適量，共6份，精密稱定，按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下條件分別在500和300MHz儀器上進(jìn)行測定。結(jié)果表明，以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內(nèi)標(biāo)（n＝6）時(shí)，其含量測定值的RSD分別為0.13%和0.05%。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液分別在0，10，12和16h進(jìn)樣測定，結(jié)果西他沙星與內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱和齊多夫定的峰面積比值的RSD（n＝4）分別為0.05%和0.04%。表明供試品溶液室溫放置16h穩(wěn)定。2.9 耐用性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在298，303和308K溫度下各連續(xù)測定5次。西他沙星與內(nèi)標(biāo)定量峰積分面積比值的RSD均為0.06%，說明在298～308K范圍內(nèi)，不同溫度對樣品的含量測定結(jié)果基本無影響。

3 討論

3.1 溶劑的選擇 理想的溶劑應(yīng)該對待測樣品有較好的溶解性、不與樣品相互作用且黏度小。西他沙星在磷酸中微溶，在0.1mol·L－1鹽酸、乙腈、甲醇中略溶，在無水乙醇中極微溶解，在水中幾乎不溶，根據(jù)溶解性及所選內(nèi)標(biāo)在二甲亞砜中較易溶解的性質(zhì)，考慮用DMSO－d6作溶劑。但在實(shí)際操作過程中發(fā)現(xiàn)，西他沙星在DMSO－d6中溶解性較差，且活潑質(zhì)子信號干擾所選定量峰，可加入重水以消其干擾，但溶解性仍未改善。根據(jù)樣品在0.1mol·L－1鹽酸中略溶的特性，考慮加入適量的DCl為溶劑。通過考查比較加入不同比例DCl后樣品的溶解性，最終確定測定溶劑為DMSO－d6∶DCl（44.8mg·L－1）＝4∶1，在此溶劑配比下，內(nèi)標(biāo)穩(wěn)定，溶解性好，滿足定量要求。

圖2 1H－NMR圖a.西他沙星和鹽酸吉西他濱的混合溶液；b.西他沙星和齊多夫定的混合溶液；c.鹽酸吉西他濱；d.齊多夫定；e.西他沙星Fig.2 1H－NMR spectraa.mixed solution of sitafloxacin and gemcitabine hydrochloride；b.mixed solution of sitafloxacin and zidovudine；c.gemcitabine hydrochloride；d.zidovudine；e.sitafloxacin

3.2 內(nèi)標(biāo)的選擇 理想的內(nèi)標(biāo)應(yīng)滿足以下條件：定量峰與樣品峰分離，溶于測試溶劑，不與待測樣品相互作用等。根據(jù)西他沙星的氫譜可選擇在低場區(qū)（5.5～7.7和8～8.5）出現(xiàn)信號的物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)。據(jù)以上條件，分別測定齊多夫定、鹽酸吉西他濱的氫譜。結(jié)果表明，鹽酸吉西他濱（δ8.12，d；δ6.21，d；δ6.02，dd）、齊多夫定（δ7.61，d；δ6.01，t）在化學(xué)位移值5.5～7.7和8～8.5的信號峰形簡單，與樣品無重疊，且鹽酸吉西他濱和齊多夫定相對分子質(zhì)量較大，與西他沙星相對分子質(zhì)量之比約為1∶2，所選信號均各含1個質(zhì)子，作為內(nèi)標(biāo)稱樣量與樣品稱樣量近似，可減少稱量誤差，溶解性好，因此，選擇鹽酸吉西他濱和齊多夫定作為內(nèi)標(biāo)。

3.3 定量峰的選擇 所選擇的定量峰應(yīng)該尖銳、孤立，性質(zhì)穩(wěn)定，若化合物中多個信號峰均符合條件，最好全部采用，取其平均值，以減小誤差。根據(jù)西他沙星氫譜可知，其在化學(xué)位移3～9范圍內(nèi)，有4個峰（δ8.69，δ7.76，δ3.43和δ3.14）相對獨(dú)立，與鹽酸吉西他濱內(nèi)標(biāo)峰（δ8.12，δ6.21和δ6.02）及齊多夫定內(nèi)標(biāo)峰（δ7.61和δ6.01）均無重合。因此，選定δ8.69（1H，d），δ7.76（1H，d），δ3.43（1H，d）和δ3.14（1H，d）為西他沙星定量峰，δ8.12（1H，d），δ6.21（1H，d）和δ6.02（1H，dd）為內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱的定量峰，δ7.61（1H，d）和δ6.01（1H，t）為內(nèi)標(biāo)齊多夫定的定量峰。

3.4 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的選擇

3.4.1 延遲時(shí)間（d1）的選擇 脈沖延遲時(shí)間（d1）是定量實(shí)驗(yàn)中非常重要的參數(shù)，要確保其足夠長（≥5 ×T1）［14］，以使原子核完全弛豫，從而使被積分的信號強(qiáng)度與原子核數(shù)目成正比。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)d1≥10s后，樣品定量峰積分面積不再變化。為滿足此條件且縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，選擇d1為20s。

3.4.2 采樣次數(shù)（ns）的選擇 采樣次數(shù)（ns）直接影響信號的信噪比，對于1H－NMR，一般要求信噪比（S／N）≥250［12］，采樣次數(shù)越多信噪比越好，但檢測時(shí)間也越長。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)ns≥16時(shí)，其信噪比已滿足定量分析要求，通過綜合考慮選擇ns為32。

4 結(jié)論

對于西他沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量測定，由于各國藥典尚未收載質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)且有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少，故對其研究具有重要意義。本文首次采用1H－NMR法，以鹽酸吉西他濱和齊多夫定為內(nèi)標(biāo)，DMSO－d6∶DCl（44.8 mg·L－1）＝4∶1為溶劑，直接稱量法配制供試品溶液，在理想的實(shí)驗(yàn)條件下，選擇δ8.69（1H，d），δ7.76（1H，d），δ3.43（1H，d）和δ3.14（1H，d）為西他沙星定量峰，δ8.12（1H，d），δ6.21（1H，d）和δ6.02（1H，dd）為內(nèi)標(biāo)鹽酸吉西他濱的定量峰，δ7.61（1H，d）和δ6.01（1H，t）為內(nèi)標(biāo)齊多夫定的定量峰，測得西他沙星含量分別為99.26%（RSD為0.06%）和99.22%（RSD為0.17%）。所建立的方法操作簡便、快速準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、不破壞樣品、綠色環(huán)保，為西他沙星研發(fā)過程中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量測定提供了一種新的方法，為其質(zhì)量控制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。因此，QNMR法可作為該創(chuàng)新藥物絕對含量的測定方法之一，也適用于其他新藥的含量測定。

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Quantitative determination of sitafloxacin hydrate by proton nuclear magnetic resonance（1H－NMR）

ZHANG Fenfen1，JIANG Menghong2，SUN Linlin1，MAO Lishun3，SHEN Wenbin4＊（1.Department of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China；2.Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China；3.Jiangsu Carefree Medicinal Limited Company，Nanjing 210016，China；4.Pharmaceutical Research Institute，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

Abstract：Objective To establish a novel method to determine the absolute content of sitafloxacin hydrate by1H－nuclear magnetic resonance（1H－NMR）.Methods The ideal spectra were obtained by Bruker AVANCE－500and AVANCE－300in 0.5mL solutions of DMSO－d6∶hydrochloric acid－d（DCl，44.8mg·L－1）＝4∶1，with gemcitabine hydrochloride and zidovudine as internal standards（IS），signals atδ8.69，δ7.76，δ3.43andδ3.14of sitafloxacin，δ8.12，δ6.21andδ6.02of gemcitabine hydrochloride and δ7.61andδ6.01of zidovudine were selected for quantitative analysis with detection conditions as follows：the probe temperature was 303Kand spectrum width（SW）was 11.0with center frequency（O1P）at 4.9，the pulse sequence was zg 30°，delay time（d1）was 20s，number of scans（ns）was 32，and line broadening（lb）was 0.3Hz.Results The sample and internal standards i.e.gemcitabine hydrochloride and zidovudine showed good separation，high precision and repeatability.The linearity ranges with equations，Y＝1.440 9 X＋0.017 8（r＝1.000 0，n＝5）and Y＝1.634 6 X＋0.008 5（r＝0.999 9，n＝5）were in the mass ratio range of 0.354 9－1.343 9and 0.312 4－1.189 2.The contents of sitafloxacin hydrate were 99.26%（RSD＝0.06%）and 99.22%（RSD＝0.17%），respectively.Conclusion This method was accurate，specific，simple，and rapid and can be used for the quantitative determination of the absolute content of sitafloxacin hydrate.

proton nuclear magnetic resonance（1H－NMR）；sitafloxacin hydrate；determination

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.010

R927.2

A

1004－2407（2015）02－0137－05

2014－09－10）

張芬芬，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：沈文斌，男，副研究員