白 甫，朱麗紅，柳小莉，唐志書(shū)，郭東艷

(陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712046)

花生衣為豆科植物落花生(Arachis hypogaea L.)的種皮，味甘、微苦、性平，具有健脾和胃、養(yǎng)血止血、散瘀消腫之功。文獻(xiàn)報(bào)道［1］其主要含有脂質(zhì)、鞣質(zhì)、甾醇、花生苷、花生衣色素、兒茶素等成分，其中主要色素成分為黃酮類(lèi)化合物。文獻(xiàn)報(bào)道［2-3］花生衣具有止血作用、抗纖維蛋白溶解、促進(jìn)骨髓制造血小板、縮短出血時(shí)間、加強(qiáng)毛細(xì)血管的收縮、調(diào)整凝血因子缺陷等功能。臨床試驗(yàn)觀察結(jié)果［4-6］表明，花生衣湯能提高化療周期患者的血紅蛋白、提高肝硬化患者的血小板數(shù)及具有防止化療引起血小板降低的作用。近年來(lái)廣泛用于胃腸、肺、子宮等內(nèi)臟出血及放化療引起的血小板減少癥等。但鮮有花生衣提取工藝研究的文獻(xiàn)報(bào)道［7-8］。本文擬采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化花生衣中總黃酮的提取工藝，以期為今后進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料 花生衣購(gòu)于西安盛興中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院王繼濤老師鑒定為豆科植物落花生(Arachis hypogaea L.)的種皮;蘆丁對(duì)照品(中國(guó)生物制品檢定所，批號(hào)100080-200707)，兒茶素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào):110877-201102);甲醇、乙腈為色譜純(Fisher公司);其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2695泵，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器;UV-1102型紫外分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司);WJN-50多功能真空濃縮機(jī)(韓國(guó));梅特勒GB204電子天平(萬(wàn)分之一);KH-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);D101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定［9］

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取在105℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.0 mg，置50 mL量瓶中，加20 mL甲醇，超聲處理溶解，再用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密移取樣品液1 mL，用50%甲醇定容至50 mL量瓶中。精密吸取0.5～25 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 總黃酮最大吸收波長(zhǎng)的確定 分別對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果均在510 nm處有強(qiáng)吸收峰。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液2，3，4，5，6，7 mL，分別置 25 mL 量瓶中，各加水至 6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法(《中國(guó)藥典》附錄ⅤA)，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程A=11.339X－0.035，r2=0.999 7，結(jié)果表明蘆丁在0.016～0.056 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 樣品中總黃酮含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液1 mL，加水至6.0 mL，按2.1.4項(xiàng)下“加50%亞硝酸鈉溶液1 mL”起，至“在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度”，記錄吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

2.2 兒茶素含量測(cè)定［10］

2.2.1 兒茶素對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取兒茶素對(duì)照品10 mg，置于50 mL量瓶中，加入50%的甲醇溶解并定容至刻度，即得濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取花生衣樣品液1 mL，用50%甲醇定容至50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度。搖勻，即得。

2.2.3 色譜條件 色譜柱:Thermo BDS Hypersil C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈-水(10∶90);檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;流速:1 mL/min;柱溫30℃。

2.2.4 含量測(cè)定 精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算兒茶素的含量。

2.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選總黃酮提取工藝

2.3.1 評(píng)價(jià)指標(biāo)的確定 總黃酮作為花生衣的主要成分，是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，原花青素是花生衣總黃酮的主要組成部分，而原花青素主要有兒茶素和表兒茶素的單體或多聚體組合而成，兒茶素具有防治心血管疾病、預(yù)防癌癥等多種功能。它為還原性多元酚類(lèi)物質(zhì)，在水溶液中易被空氣氧化，常用作抗氧化劑。右旋兒茶素還有降低毛細(xì)血管的通透性、止瀉、止血、抗病毒、殺真菌、及預(yù)防胃潰瘍等多種作用，所以將兒茶素的含量定為另一評(píng)價(jià)指標(biāo)。根據(jù)各指標(biāo)成分在工藝選擇中的主次地位，給予不同的加權(quán)系數(shù)，求出綜合評(píng)價(jià)指標(biāo) Y［11］。

2.3.2 各因素水平的確定 采用軟件Design-Expert 8.0.5中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、液料比與提取時(shí)間3個(gè)因素，分別以A，B，C表示，每個(gè)自變量的低中高水平分別以－1，0，1進(jìn)行編碼，總黃酮與兒茶素含量為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。因素水平分析選取見(jiàn)表1。

表1 花生衣總黃酮提取工藝響應(yīng)面因素水平編碼

2.3.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2～表3。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案與試驗(yàn)結(jié)果

表3 二次回歸方程方差分析

2.3.4 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 用軟件分析響應(yīng)面的回歸參數(shù)，建立各影響因素之間的數(shù)學(xué)模型，以綜合評(píng)分為響應(yīng)值的方差分析可知，一次項(xiàng) A＜0.01，各因素對(duì)響應(yīng)值Y的線性關(guān)系顯著;二次項(xiàng)A2、B2對(duì)響應(yīng)值(綜合評(píng)分)Y的曲面效應(yīng)顯著。利用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)值Y對(duì)乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)回歸模型:Y=19.03+0.49×A+0.22×B－0.037×C－0.16×A×B+0.25×A×C－0.026×B×C－1.53×A2－0.70×B2－0.03×C2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)的相關(guān)知識(shí)分析，由表3可知，整體數(shù)學(xué)模型達(dá)到顯著水平(P＜0.01)，表明在試驗(yàn)因子與響應(yīng)值確定的回歸方程中，其應(yīng)變量與各個(gè)自變量之間的線性關(guān)系極顯著，說(shuō)明該二次方程模型比較顯著。模型的失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05)，該方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好，可以對(duì)不同條件下的總黃酮含量進(jìn)行預(yù)測(cè)。此外，該模型的變異系數(shù)(CV)為1.97%，在可接受范圍內(nèi)。數(shù)學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)r2=0.943 2。綜合分析表明用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)花生衣中總黃酮的提取工藝結(jié)果是比較合適的。在回歸方程模型中，對(duì)各因變量進(jìn)行的方差分析結(jié)果表明:模型一次項(xiàng)A差異極顯著;交互項(xiàng)差異不顯著;各個(gè)二次項(xiàng)A2、B2差異極顯著，說(shuō)明不能用簡(jiǎn)單的線性關(guān)系來(lái)描述試驗(yàn)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。從回歸方程的系數(shù)值和方差分析結(jié)果可以看出，在響應(yīng)面的試驗(yàn)范圍內(nèi)，各個(gè)試驗(yàn)因素的主效應(yīng)關(guān)系為:乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間。各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)花生衣總黃酮得率影響的響應(yīng)曲面及等高線見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 Y=f(A，B)的等高線圖與響應(yīng)面

圖2 Y=f(A，C)的等高線圖與響應(yīng)面

圖3 Y=f(B，C)的等高線圖與響應(yīng)面

經(jīng)分析計(jì)算后可知，花生衣的最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇濃度為39.12%，液料比為16.27倍，提取時(shí)間為31 min。但考慮到實(shí)際生產(chǎn)條件及方差分析結(jié)果，確定優(yōu)化提取條件為:提取溶劑為40%乙醇，液料比為15倍，提取時(shí)間為30 min，并按此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

從多元回歸方程中，可以得到各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)花生衣總黃酮得率影響的響應(yīng)曲面及等高線圖(圖1～圖3)。由圖響應(yīng)面圖可知，得到響應(yīng)面圖開(kāi)口向下，隨著每個(gè)試驗(yàn)因素的增大，響應(yīng)面對(duì)應(yīng)的值相應(yīng)增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著各因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小。該模型有穩(wěn)定點(diǎn)，最大值就是其穩(wěn)定點(diǎn)。

2.3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按照響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳工藝條件重復(fù)3次，以驗(yàn)證該提取工藝條件是否具有重現(xiàn)性。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

結(jié)果表明，響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)選的花生衣提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 小結(jié)

有關(guān)花生衣總黃酮提取方法的選擇在預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別采用了超聲提取法和回流提取法，以總黃酮及兒茶素含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果兩種方法的兒茶素得率和總黃酮得率都相差不大，考慮到大生產(chǎn)的設(shè)備以及經(jīng)濟(jì)條件等選擇回流提取法。

在實(shí)驗(yàn)的因素水平設(shè)置中，采用單因素試驗(yàn)法，對(duì)影響提取效率的浸提次數(shù)，浸提溶劑，液料比，浸提溫度，浸提時(shí)間等進(jìn)行了考察，以總黃酮及兒茶素含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終確定了試驗(yàn)中的因素水平數(shù)。

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