李知敏， 孫彥敏， 彭 亮， 劉 瑤， 杜 賀

（江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330013）

幾種灰兜巴提取物配伍對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的影響

李知敏， 孫彥敏， 彭 亮*， 劉 瑤， 杜 賀

（江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330013）

目的研究中藥灰兜巴石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分、醇提萃取剩余部分和水提部分5部分對(duì)于α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。方法通過高效液相色譜法檢測(cè)不同灰兜巴提取物單因素及相互配伍后對(duì)于α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。結(jié)果灰兜巴各部分提取物均表現(xiàn)出良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，不同比例提取物配伍后對(duì)于α-葡萄糖苷酶的抑制作用明顯升高，通過DPS數(shù)據(jù)分析可得出，灰兜巴乙酸乙酯部分對(duì)于α-葡萄糖苷酶的抑制作用最強(qiáng)，配伍后最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的抑制率可高達(dá)98.62%。結(jié)論證明灰兜巴具有良好的降糖療效，且相互配伍有助于增強(qiáng)對(duì)于α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

灰兜巴；α-葡萄糖苷酶；配伍；抑制活性；高效液相色譜

糖尿病是由于糖類物質(zhì)新陳代謝變動(dòng)導(dǎo)致胰島素分泌受限而使得血糖過高引起的。近年來，糖尿病患者長(zhǎng)期血糖過高的狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致眼、腎、心血管以及神經(jīng)系統(tǒng)障礙，引起多種并發(fā)癥［1］。糖尿病及其并發(fā)癥所導(dǎo)致的死亡率已超越癌癥和其他疾?。?］。臨床上治療糖尿病的藥物通常價(jià)格昂貴且副作用大［3］，因此從天然藥物中尋找一種簡(jiǎn)單有效、安全的藥物受到越來越多的人的關(guān)注。α-葡萄糖苷酶抑制劑作為一種新型抗糖尿病方法近幾年來常被用來治療糖尿病。臨床上有阿卡波糖和伏格列波糖［4］作為α-葡萄糖苷酶抑制劑用來延遲葡萄糖吸收，前人實(shí)驗(yàn)［5-6］證明中藥抑制α-葡萄糖苷酶可有效治療糖尿病?；叶蛋陀置]口袋，曾經(jīng)被認(rèn)為是一種山蜘蛛寄生在海拔1 500 m以上的峨眉山老茶樹頭部生長(zhǎng)出來的菌科植物［7］，后經(jīng)鑒定確認(rèn)該藥材為地蛛科地蛛屬卡氏地蛛（Atypus karschi Doenitz）在老茶樹根部所筑的巢穴。作為一種民族藥，灰兜巴已經(jīng)近千年來被峨眉山地區(qū)居民用于糖尿病的預(yù)防及治療。其有“仙山靈藥”、“糖尿病克星”和 “天然純綠色的大自然珍寶”［8］的美譽(yù)。

不管是單種中藥還是中藥復(fù)方，其臨床療效都是通過活性成分或活性成分群產(chǎn)生的［9］。所謂 “中藥組效關(guān)系”（combination-activity relationship，CAR）是指在不同層次上的中藥物質(zhì)相互組合與藥效活性之間的關(guān)聯(lián)［10］。本實(shí)驗(yàn)中采用HPLC分析傳統(tǒng)民族藥灰兜巴提取物各配伍比例中對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。將灰兜巴提取部位加以配伍組合，觀察在酶抑制上是否有增強(qiáng)作用及何種比例獲得最佳效果，并通過DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行極差方差分析，研究灰兜巴不同提取部位的活性差異。從中藥材成分組合物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效相關(guān)性方面，為傳統(tǒng)中藥方劑學(xué)配伍原理、組方分析和藥物治療等方面提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 灰兜巴購(gòu)自于峨眉山灰兜巴批發(fā)零售中心。并實(shí)地采集民間習(xí)稱的山蜘蛛，經(jīng)江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院熊志華老師鑒定，確認(rèn)該蜘蛛實(shí)為地蛛科地蛛屬的卡氏地蛛Atypus karschi Doenitz，而灰兜巴則為卡氏地蛛于老茶樹根部所筑的巢穴。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）及還原型谷胱甘肽均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；對(duì)硝基苯酚 （PNP）購(gòu)自于上海源葉生物科技有限公司；無水碳酸鈉（Na2CO3）、二甲亞砜（DMSO）、pH 6.8磷酸鉀 （PBS）緩沖液、甲酸、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，甲醇，乙腈為色譜純。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 Agilent 1100高效液相色譜儀（安捷倫有限公司）；Vortex-Genie2渦旋振蕩器（美國(guó)Scientific Industries公司）；LR 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （德國(guó)海道夫公司）；FA2004N電子天平 （上海精密科學(xué)儀器有限公司）；XS203S電子精密天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HPLC分析色譜條件 Kromasil 100-5 C18（4.6 mm× 250mm，5μm）色譜柱；Agilent C18（4.6 mm×12.5 mm，5μm）保護(hù)柱；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫 （0～8 min，20%～30%A；8～13 min，30%～80%A；13～18 min，80%～20%A；18～28min，20%A）；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20μL；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)314 nm。

2.2 高效液相法測(cè)定灰兜巴對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性

取灰兜巴醇提液分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到灰兜巴石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物，醇提萃取剩余物，灰兜巴醇提后濾渣用水提得灰兜巴水提物。

取一支試管，依次加入67 mmol/L pH 6.8的磷酸鉀緩沖液1.0 mL，3 mmol/L谷胱甘肽溶液0.2 mL，0.04 mg/ mLα-葡萄糖苷酶溶液0.3 mL，灰兜巴各部分提取物0.3 mL，渦旋振蕩器混勻，37℃水浴保溫10 m in后，加入0.2 mg/m LpNPG溶液0.5 mL，渦旋振蕩器混勻，反應(yīng)每2 min震蕩5 s，10 min后，再加入0.1 mol/L碳酸鈉溶液8 mL終止反應(yīng)，反應(yīng)后溶液過0.45μm微孔濾膜后，用HPLC按“2.1”項(xiàng)條件進(jìn)行檢測(cè)，將PNP峰面積記為A1。

另取一試管，不加實(shí)驗(yàn)樣品溶液，實(shí)驗(yàn)步驟同上，將PNP峰面積記為A2。按下面公式計(jì)算灰兜巴不同提取部分對(duì)于α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

α-葡萄糖苷酶抑制率：

酶活性抑制率=（A2-A1）/A2×100%

2.3 灰兜巴各提取部分測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性單因素研究 分別取0.06、0.07、0.08 mg/mL質(zhì)量濃度的灰兜巴石油醚萃取物；0.05、0.06、0.07 mg/mL質(zhì)量濃度的灰兜巴乙酸乙酯萃取物；0.1、0.2、0.3 mg/mL質(zhì)量濃度的灰兜巴正丁醇萃取物；0.5、1.0、2.0 mg/mL質(zhì)量濃度的灰兜巴醇提萃取剩余物；0.5、1.0、2.0 mg/mL質(zhì)量濃度的灰兜巴水提物。按 “2.2”項(xiàng)中反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)并計(jì)算其各部分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

2.4 灰兜巴各提取部分測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性不同比例配伍研究 為考察各灰兜巴提取物不同質(zhì)量濃度配比后，對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，設(shè)計(jì)五因素四水平正交試驗(yàn)，因素和水平安排見表1。試驗(yàn)按照L16（45）正交表進(jìn)行，由于試驗(yàn)表中無空白列，故每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，試驗(yàn)結(jié)果用DPS 13.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行極差分析和方差分析。

表1 因素水平

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 線性關(guān)系考察 精密稱取0.020 9 g PNP標(biāo)準(zhǔn)品，用磷酸鹽緩沖溶液超聲溶解，定容于25 mL量瓶中，配制成6 mmol/L的PNP母液，將母液分別稀釋成0.002 5、0.005、0.01、0.05、0.1mmol/L。

將上述不同濃度的PNP標(biāo)準(zhǔn)品按照 “2.1”項(xiàng)中色譜條件測(cè)定，以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得回歸方程為y=6 599.6x+1.273 4，r2= 0.999 8，說明PNP在0.002 5～0.1 mmol/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.1 mmol/L PNP溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄HPLC圖。并計(jì)算其峰面積的RSD值為0.295%，表明儀器精密度良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取0.1 mmol/L PNP溶液，分別在0、1、2、3、4、5、6 h不同時(shí)間進(jìn)樣20μL，記錄峰面積，計(jì)算其RSD值，檢測(cè)PNP的穩(wěn)定性。其RSD值為0.65%，證明PNP在此條件下穩(wěn)定性良好。

3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 在相同條件下重復(fù)制備樣品6次，按“2.1”項(xiàng)中色譜條件檢測(cè)，其RSD值為0.79%，表明此反應(yīng)條件操作可重復(fù)性較好。

3.1.5 回收率試驗(yàn) 不加反應(yīng)藥液，將α-葡萄糖苷酶替換為PNP標(biāo)準(zhǔn)溶液做陰性對(duì)照，取樣量分別為0.3 m L的60%、80%、100%、120%、140%，實(shí)驗(yàn)測(cè)得回收率分別為 98.08%、101.13%、100.97%、99.24%、101.29%，RSD值為1.42%，由此證明標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確性良好。

3.2 灰兜巴各提取部分測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性單因素研究 按 “2.1”項(xiàng)中反應(yīng)條件檢測(cè)灰兜巴不同質(zhì)量濃度各提取部分的α-葡萄糖苷酶抑制活性，在13.9 min出現(xiàn)PNP峰，以峰面積計(jì)算α-葡萄糖苷酶抑制率，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見 表2。

表2 灰兜巴各提取部分單獨(dú)作用時(shí)測(cè)定α-葡萄糖苷酶的抑制率 （%，，n=5）

表2 灰兜巴各提取部分單獨(dú)作用時(shí)測(cè)定α-葡萄糖苷酶的抑制率 （%，，n=5）

L 2.0mg/mL石油醚萃取物 — 14.65±2.80 30.21±4.32 54.80±1.63萃取物類別 0.05 mg/mL 0.06 mg/mL 0.07mg/mL 0.08 mg/mL 0.1mg/mL 0.2 mg/mL 0.3 mg/mL 0.5 mg/mL 1.0 mg/m——————乙酸乙酯萃取物 36.05±3.36 48.96±1.69 64.41±2.26 — — — — — — —正丁醇萃取物 — — — — 15.46±2.62 28.85±0.98 48.23±2.74 — — —醇提萃取剩余物 — — — — — — — 1.64±3.10 4.27±2.44 8.54±2.02水提物 — — — — — — —1.32±1.27 1.92±3.48 4.15±3.01

3.3 灰兜巴各提取部分測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性不同比例配伍研究 依據(jù)灰兜巴5種提取物的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表，進(jìn)行試驗(yàn)，其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率和極差分析結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 灰兜巴各提取部分測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性不同比例配伍研究

表4 灰兜巴提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用正交設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

由表3的極差分析結(jié)果可以看出，灰兜巴乙酸乙酯萃取物的極差最大，對(duì)α-葡萄糖苷酶的影響最顯著，其次是石油醚萃取物、正丁醇萃取物和水提物，而醇提萃取剩余部分的影響最小。

由表4的方差分析可知，灰兜巴5部分提取物的P值小于0.01，證明這5種提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用均存在顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由極差分析結(jié)果和方差分析結(jié)果可知，灰兜巴提取物的最佳配比為A4B4C4D3E2，即灰兜巴石油醚萃取物0.08mg/mL、乙酸乙酯萃取物0.07 mg/mL、正丁醇萃取物0.3 mg/mL、醇提萃取剩余物1.0 mg/mL和水提物0.5 mg/mL。按照該配比進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，α-葡萄糖苷酶的抑制率為98.62%±0.15%（試驗(yàn)重復(fù)3次）。

4 討論

中藥起藥效作用的特點(diǎn)為多種成分共同相互作用，體現(xiàn)了傳統(tǒng)中藥與西藥的主要區(qū)別。中藥組效關(guān)系旨在研究中藥的有效成分相互配伍與其藥效之間的關(guān)系，對(duì)于揭示中藥多指標(biāo)的質(zhì)量控制和中藥的作用特點(diǎn)有著重要意義［11］。

前期試驗(yàn)中已證實(shí)灰兜巴各個(gè)提取部分單獨(dú)使用時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶存在抑制作用，本實(shí)驗(yàn)主要以HPLC為檢測(cè)手段，以PNP作為檢測(cè)峰［12］，考察了中藥灰兜巴不同提取物按不同比例相互配伍后，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用的影響，研究灰兜巴中各種成分之間的相互影響作用。在正式試驗(yàn)前，筆者用HPLC檢測(cè)了在不加α-葡萄糖苷酶條件下，反應(yīng)液的HPLC圖，結(jié)果表明在PNP的保留時(shí)間（13.9min）處沒有峰出現(xiàn)，證明灰兜巴各提取物在反應(yīng)條件下不會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的檢測(cè)產(chǎn)生干擾。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，灰兜巴提取物配伍后，其α-葡萄糖苷酶抑制率較單種提取物均明顯升高，證明灰兜巴各提取部分配伍后對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用增強(qiáng)。但與各提取物單獨(dú)作用于α-葡萄糖苷酶后的抑制率之和相比，配伍后的抑制率明顯降低，如正交試驗(yàn)中的第7組試驗(yàn)，0.06 mg/mL的石油醚萃取物、0.06 mg/mL的乙酸乙酯萃取物、0.3mg/mL正丁醇萃取物和0.5 mg/mL的水提物組合后，α-葡萄糖苷酶的抑制率平均值為93.04%，而根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，這4種提取物相應(yīng)濃度的抑制率之和為113.25%，即理論上，如果這四種提取物同時(shí)存在時(shí)，應(yīng)該完全抑制α-葡萄糖苷酶的活性。出現(xiàn)這種情況的原因，可能是由于中藥在人體內(nèi)起作用是一個(gè)多成分、多靶點(diǎn)［13］的過程，而本實(shí)驗(yàn)中選用的α-葡萄糖苷酶抑制模型，是藥物單靶點(diǎn)作用，各提取物的成分在抑制α-葡萄糖苷酶活性的過程中存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，從而使配伍后的抑制率反而降低。這個(gè)結(jié)論提示，在研究中藥的組效關(guān)系時(shí)，藥理模型應(yīng)盡量避免選擇作用靶點(diǎn)單一的模型，最好選用離體細(xì)胞或是整體動(dòng)物等存在多靶點(diǎn)的模型。

綜上，灰兜巴作為一種民族藥，可通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性發(fā)揮其降糖作用，經(jīng)組效配伍后其抑制作用明顯增強(qiáng)，證明灰兜巴中各成分之間存在相互作用且有利于增強(qiáng)藥物對(duì)酶的抑制作用。對(duì)于研究糖尿病的預(yù)防和治療具有十分重要的意義，且具有廣闊的市場(chǎng)前景。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0879-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.043

2014-02-27

江西省青年科學(xué)基金 （20122BAB215019）

李知敏 （1980—），女，碩士，講師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方向研究。Tel：13732967677，E-mail：Lzmin3026@163.com

*通信作者：彭 亮 （1980—），男，博士，副教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方向研究。Tel：13576033885，E-mail：pengliang8036@ 163.com