黎 珊， 高 明， 陳 康*， 陳燕霞， 張林杰

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405）

［飲片炮制］

蒸制時(shí)間對(duì)佛手主要成分與抗氧化活性的影響

黎 珊1， 高 明1， 陳 康1*， 陳燕霞2， 張林杰1

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405）

目的研究不同蒸制時(shí)間對(duì)佛手總黃酮、橙皮苷及5，7-二甲氧基香豆素成分及其抗氧化活性的影響。方法采用紫外分光光度法測定佛手總黃酮含有量；HPLC法測定橙皮苷及5，7-二甲氧基香豆素含有量；DPPH法檢測這些化合物的抗氧化活性。結(jié)果2.5 h蒸制時(shí)間對(duì)佛手總黃酮和橙皮苷的含有量均出現(xiàn)峰值，分別達(dá)到50.416 mg/g和1.038 mg/g，蒸制后5，7-二甲氧基香豆素含有量呈減少趨勢，2.5 h蒸制下降最少，為1.628mg/g。蒸制2.5 h的佛手抗氧化能力最強(qiáng)。結(jié)論蒸制時(shí)間對(duì)制佛手主要成分及抗氧化均有顯著影響，且總黃酮和橙皮苷的量與其抗氧化活性之間具有相關(guān)性。

佛手；蒸制；總黃酮；橙皮苷；5，7-二甲氧基香豆素；動(dòng)態(tài)變化；抗氧化

佛手為蕓香科植物佛手Citrusmedical L.var. sarcodactylis Swingle的干燥果實(shí)［1］，主產(chǎn)于廣東高要、德慶等地，為十大廣藥之一。現(xiàn)代研究表明，佛手含有揮發(fā)油、檸檬油素、香葉木苷、橙皮醇、香豆素、黃酮等［2-5］20多種化學(xué)成分，具有止咳、化痰、平喘、健胃、止嘔、抗炎、抗驚厥、抗癌等［6-13］藥理作用。制佛手為嶺南特色飲片，臨床應(yīng)用時(shí)以佛手蒸制后入藥，以降低辛燥性，但目前對(duì)佛手蒸制過程中其主要成分的變化尚無相關(guān)研究，以致蒸制時(shí)間的確定無相應(yīng)的理論依據(jù)支持。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同蒸制時(shí)間的制佛手主要成分動(dòng)態(tài)變化以及抗氧化性進(jìn)行研究，為佛手炮制機(jī)理及生產(chǎn)工藝提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，2998 PDA檢測器，Empower3色譜工作站（美國沃特世公司）；Thermo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm，美國賽默飛世爾科技公司）；8453E紫外可見分光光度計(jì)（美國Agilent科技公司）。

1.2 對(duì)照品及試藥 橙皮苷 （中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110721-201115）；5，7-二甲氧基香豆素 （中國藥品生物制品檢定所，批號(hào) 120711-201213）；無水乙醇 （分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇 （色譜純，德國默克公司）；醋酸 （色譜純，美國Tedia公司）；水為怡寶純凈水。

1.3 藥材 佛手飲片購買于廣州中藥飲片廠，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)高明副教授鑒定為蕓香科植物佛手Citrusmedical L.var.sarcodactylis Swingle的干燥果實(shí)。

2 方法及結(jié)果

2.1 佛手的炮制 取佛手飲片8份，各加20%蒸餾水悶潤約1 h，分別置于蒸籠中，待圓氣后，分別蒸 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，燜過夜，取出，攤開，60℃烘干。分別打粉，過3號(hào)篩，即得樣品粉末。

2.2 UV法測定總黃酮

2.2.1 對(duì)照品的制備 取橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含19.96μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品的制備 取樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入80% 甲醇溶液100 mL，超聲60 min，過濾，揮干，殘?jiān)?0 mL蒸餾水，超聲10 min溶解，溶液轉(zhuǎn)移至已處理好的聚酰胺柱，用80mL蒸餾水沖洗，洗脫液棄去，用100 mL80%甲醇洗脫，洗脫液揮干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，移至25 mL量瓶中，定容備用。

2.2.3 線性關(guān)系 精密量取橙皮苷對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，定容。在330 nm下測定其吸光度，以吸光度 （Y）對(duì)橙皮苷質(zhì)量濃度 （X， mg/mL）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。回歸方程為Y=5.526 3X-0.008 7，r=0.999 0，結(jié)果表明橙皮苷在9.98～79.84μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 總黃酮測定 精密量取供試品溶液1 m L，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法測定，記錄吸光度，每批樣品平行測定3次，計(jì)算總黃酮的量，結(jié)果見表1。

表1 樣品中有效成分測定結(jié)果 （，n=3）Tab.1 Results of conten t determ ination of sam p les（，n=3）

表1 樣品中有效成分測定結(jié)果 （，n=3）Tab.1 Results of conten t determ ination of sam p les（，n=3）

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2.3 HPLC法測定橙皮苷及5，7-二甲氧基香豆素

2.3.1 色譜條件

2.3.1.1 橙皮苷 參照 《中國藥典》2010年版［1］，Thermo C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸 （33：63：2）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長284 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。橙皮苷保留時(shí)間為12.116 min。

2.3.1.2 5，7-二甲氧基香豆素 參照文獻(xiàn)［13］，Thermo C18色譜柱；流動(dòng)相為甲醇-水 （65：35）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長326 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL。5，7-二甲氧基香豆素保留時(shí)間為5.016 min。

2.3.2 對(duì)照品的制備 取橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40μg的溶液。取5，7-二甲氧基香豆素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 m L含101μg的溶液。

2.3.3 供試品的制備 取樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 取橙皮苷對(duì)照品溶液，進(jìn)樣2、4、6、8、10、12μL，按照 “2.3.1”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，以峰面積 （Y）對(duì)橙皮苷的量 （X，μg）進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表2。

取5，7-二甲氧基香豆素對(duì)照品溶液，進(jìn)樣2、4、6、8、10、12μL，按照 “2.3.1”項(xiàng)下進(jìn)樣分析，以峰面積 （Y）對(duì)5，7-二甲氧基香豆素的量（X，μg）進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表2。

表2 橙皮苷和5，7-二甲基香豆素的回歸方程Tab.2 Results of linear range of hesperiden and 5，7-dimethoxycoumarin

2.3.5 橙皮苷及5，7-二甲氧基香豆素測定 供試品溶液按 “2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，每批樣品平行測定3次，計(jì)算橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素的量，結(jié)果見表1。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：不同蒸制時(shí)間的制佛手樣品中總黃酮、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的量均存在差異。隨著蒸制不同蒸制時(shí)間的延長，樣品中總黃酮、橙皮苷的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律是先增加后降低，其中蒸制2.5 h時(shí)量最高，總黃酮為50.416 mg/g，橙皮苷為1.038 mg/g；蒸制4 h時(shí)量最低。炮制后5，7-二甲氧基香豆素量明顯低于生品，其中蒸2.5 h的樣品中5，7-二甲氧基香豆素量為次高，為1.628 mg/g。

2.4 制佛手對(duì)DPPH的清除及相關(guān)性分析

2.4.1 DPPH溶液的配制 精密稱取DPPH對(duì)照品8.0 mg，用無水乙醇定容至100 m L的量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.08 mg/m L的DPPH溶液，避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.4.2 供試品的配制 取樣品粉末約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加無水乙醇溶液40 m L，超聲40 min，過濾，濾渣加無水乙醇30 mL，超聲40 min，過濾，合并濾液，即得供試品溶液。

2.4.3 DPPH自由基清除能力測定 參考Kumazawa等［14］的方法并進(jìn)行改進(jìn)，分別精密吸取不同體積的供試品至25mL量瓶中，定容，搖勻。取稀釋后的供試品溶液3 mL，加入2 mL0.08 mg/mL的DPPH乙醇溶液，搖勻，避光放置30 min后于521 nm處測定吸光值A(chǔ)1。同時(shí)測定2 mLDPPH液與3 mL乙醇溶液的吸光度A0及2 mL乙醇與3 m L樣品溶液的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。經(jīng)IC50軟件計(jì)算IC50值，結(jié)果見表3。

表3 樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力（，n=3）Tab.3 IC50of sam p les for scavenging DPPH free rad ical（，n=3）

表3 樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力（，n=3）Tab.3 IC50of sam p les for scavenging DPPH free rad ical（，n=3）

1 5.35±0.08 1.52 2 0.5 5.13±0.09 1.77 3 1.0 4.55±0.08 1.52 4 1.5 3.36±0.06 1.78 5 2.0 2.51±0.05 1.79 6 2.5 2.39±0.01 0.30 7 3.0 3.16±0.06 1.99 8 3.5 2.92±0.03 1.14 0 9 4.0 5.47±0.26 4.81

由表3可以看出：佛手炮制前后的醇提液對(duì)DPPH自由基均有不同程度的抑制作用。其中IC50最小 （即抗氧化能力最強(qiáng)）的為蒸制2.5 h的制佛手（樣品6），為2.39 mg/m L，IC50最大為蒸制4 h的制佛手（樣品9），為5.47 mg/mL。

2.5 佛手有效成分含有量與抗氧化活性相關(guān)性分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)制佛手抗氧化活性IC50、總黃酮、橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素進(jìn)行相關(guān)性分析，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 3種有效成分與抗氧化活性相關(guān)系數(shù)Tab.4 Cor relation analysis of three com ponents and the antioxidant activity

制佛手總黃酮和橙皮苷含有量與其抗氧化活性之間具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為-0.891和-0.702，說明抗氧化活性與總黃酮和橙皮苷含有量負(fù)相關(guān)，含有量越高，IC50值越小，即抗氧化能力越強(qiáng)；佛手中5，7-二甲氧基香豆素的含有量與抗氧化活性之間相關(guān)系數(shù)0.134，二者之間相關(guān)性差。

3 結(jié)論

3.1 蒸制過程中，樣品中總黃酮、橙皮苷的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律為先增加后降低，這可能是在一定的蒸制時(shí)間內(nèi)，由于水蒸汽進(jìn)入組織細(xì)胞中，加快后者膨脹，導(dǎo)致細(xì)胞間隙變大或組織細(xì)胞膜壁破裂，提高其轉(zhuǎn)移率，含有量增加，而長時(shí)間蒸制又可能使這些成分流失或分解。另外，炮制后5，7-二甲氧基香豆素的含有量較生品明顯下降，約減少25%～46%，原因可能是此類香豆素對(duì)熱敏感，長時(shí)間高溫蒸制使其內(nèi)酯結(jié)構(gòu)開環(huán)分解，同時(shí)蒸制過程中香豆素類物質(zhì)容易氧化變質(zhì)，也可能導(dǎo)致其含有量降低。

3.2 制佛手總黃酮和橙皮苷含有量與其抗氧化活性之間具有相關(guān)性，原因可能是黃酮、橙皮苷中含有大量的酚羥基，能向脂質(zhì)過氧化自由基提供電子，使之轉(zhuǎn)化為較穩(wěn)定的過氧化脂質(zhì)，而其自身則轉(zhuǎn)變?yōu)榉踊杂苫?，抑制了氧化過程。

3.3 綜合總黃酮、橙皮苷和5，7-二甲氧基香豆素這3個(gè)考察指標(biāo)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)蒸制2.5 h后各有效成分達(dá)到較高水平，這與佛手噴水后蒸2～3 h的嶺南特色炮制工藝［15］相吻合，為合理選擇工藝參數(shù)提供了參考依據(jù)。

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Effect of steam ing time on m ain com ponents and antioxidant activity of fingered citron

LIShan1， GAO Ming1， CHEN Kang1*， CHEN Yan-xia2， ZHANG Lin-jie1

（1.School of Chinese Materia Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

AIMTo study the effect of different steaming time on the contents of total flavonoids，hesperidin and 5，7-dimethoxycoumarin from fingered citron（Citri Sarcodactylis Fructus）aswell as their antioxidantactivity.METHODSThe total flavonoids contentwasdetermined by ultraviolet spectrophotometry.The contents ofhesperidin and 5，7-dimethoxycoumarin were measured by HPLC.Antioxidant activity was evaluated by scavenging capability for DPPH free radicals.RESULTSThe steaming processmade total flavonoids contentand hesperidin from fingered citron reach the peak values（50.416 mg/g and 1.038 mg/g，respectively），5，7-dimethoxycoumarin content decrease after steaming，at2.5 h when the content decreased leastwas1.628 mg/g，and steamed fingered citron possessed the strongest antioxidant capacity.CONCLUSIONThe steaming time plays a key role in active component content and antioxidant activity，and there exists a correlation between total flavonoid，hesperidin contentand their antioxidantactivity.

fingered citron（Citri Sarcodactylis Fructus）；steaming process；total flavonoids；hesperidin；5，7-dimethoxycoumarin；dynamic change；antioxidant activity

R283

A

1001-1528（2015）04-0821-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.028

2014-09-22

廣州市荔灣區(qū)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目 （20122214066）

黎 珊 （1990—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴幣谥片F(xiàn)代化和中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。Tel：13556191760，E-mail：heyjude1234m@163.com

*通信作者：陳 康 （1961—），男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幣谥片F(xiàn)代化和中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化。E-mail：chenkang@ gzucm.edu.cn