崔紅梅， 羅 恒， 楊 軍， 楊安東

（四川省中醫(yī)院科學(xué)院，四川成都610041）

HPLC法同時測定毛果婆婆納中3種環(huán)烯醚萜苷

崔紅梅*， 羅 恒， 楊 軍， 楊安東

（四川省中醫(yī)院科學(xué)院，四川成都610041）

目的建立HPLC同時定量測定采自西藏、四川阿壩毛果婆婆納中梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷Ⅱ的方法。方法采用外標法，Gemini C18色譜柱 （110?，4.60 mm×250 mm，5μm），流動相為乙腈 （A）-水 （B）梯度洗脫（0～13min，3%A；13～20min，3%～15%A；20～50min，15%A；50～60min，15%～21%A；60～70min，21%A；70～110 min，21%～100%A），體積流量1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測波長203 nm。結(jié)果梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷Ⅱ的線性范圍分別為0.101 5～5.076μg，0.093 2～4.66μg，0.043 6～2.18μg；平均加樣回收率分別為98.9%（RSD 1.0%），103.8%（RSD 0.7%），98.8%（RSD 1.9%）。結(jié)論10個產(chǎn)地婆婆納中梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷Ⅱ的量差異明顯，高低差異近10倍之多。

毛果婆婆納；梓醇；桃葉珊瑚苷；胡黃連苷Ⅱ；環(huán)烯醚萜苷；高效液相色譜

婆婆納為玄參科Scrophulariaceae婆婆納屬Veronica植物，包括長果婆婆納V.ciliata Fisch毛果婆婆納V.eriogyne H.Winkl及同屬多種植物［1］，產(chǎn)于我國西北各地及四川、西藏［1-2］，為西北高海拔及高寒植物。全草可入藥，具有清瘡熱、生肌、止血功效，用于瘡瘍、濕疹、皮膚潰爛、出血等癥狀［1］?！吨腥A本草》記載其具有清熱解毒、祛風(fēng)利濕等功效，主治肝炎、膽囊炎、風(fēng)濕痛、蕁麻疹等［2］，被收錄于 《西藏常用中草藥》和 《國際化妝品原料字典和手冊 （第十二版）》。文獻資料顯示，苯乙醇苷類和環(huán)烯醚萜苷類化合物是婆婆納屬植物中的主要化學(xué)成分［3］。作者前期已從毛果婆婆納中分離得到兩種環(huán)烯醚萜苷類化合物——桃葉珊瑚苷 （aucubin，AU）和梓醇。桃葉珊瑚苷具有廣泛的藥理活性，它和其衍生物桃葉珊瑚苷元（aucubigenin，AG）具有護肝解毒、抗炎、抗氧化、抗衰老、抗骨質(zhì)疏松和神經(jīng)營養(yǎng)等作用［4］，近年來愈來愈引起重視［5-7］。梓醇不僅能降糖利尿［3］，保護高糖誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡［8］，而且對局灶性腦缺血后引起的神經(jīng)血管單元病變有明顯的保護作用，并能促進腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)［9］。宋沖等［10］發(fā)現(xiàn)，梓醇能顯著緩解阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）模型小鼠的焦慮情緒，這種改善作用可能是通過改善神經(jīng)元及突觸的丟失來實現(xiàn)的，還可顯著減少AD模型小鼠腦內(nèi)老年斑數(shù)量，改善其空間學(xué)習(xí)記憶能力［11］。另外，胡黃連苷等其他環(huán)烯醚萜苷類均具有廣泛的藥理活性［7，12-13］。本實驗建立了HPLC同時測定婆婆納中梓醇、桃葉珊瑚苷和胡黃連苷Ⅱ這3種環(huán)烯醚萜苷的方法，對采自西藏、四川阿壩等10個不同產(chǎn)地，海拔3 000～4 300 m山坡上的12批藥材進行了測定，為該植物納質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀系統(tǒng)，由G1311A四元梯度泵、G1315D型二極管陣列檢測器、G1329A型全自動進樣器、ChemStation高效液相色譜化學(xué)工作站組成 （美國安捷倫公司）；XS205DU電子天平 （瑞士梅特勒—托利多公司）；島津UV-2401PC紫外分光光度計 （日本島津公司）。

乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；水為超純水 （自制），其余試劑為分析純 （國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；對照品梓醇 （批號 110808-201009）、桃葉珊瑚苷 （批號111761-200601）、胡黃連苷Ⅱ （批號111596-200402）均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用。

10批樣品采自主產(chǎn)區(qū)或購自主產(chǎn)區(qū)藥材市場，2批為全人工栽培，均由西藏自治區(qū)藏醫(yī)藥研究院生藥研究所提供。經(jīng)西藏自治區(qū)藏醫(yī)藥研究院生藥研究所孟千萬博士鑒定為玄參科婆婆納屬植物毛果婆婆納Veronica eriogyne H.Winkl的全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Gemini C18色譜柱（110?，4.60 mm×250 mm，5μm）；柱溫25℃；檢測波長203 nm；流動相為乙腈 （A）-水 （B）梯度洗脫 （0～13 min，3%A；13～20 min，3%～15%A；20～50 min，15%A；50～60 min，15%～21%A；60～70 min，21%A；70～110 min，21%～100%A）；體積流量1.0 mL/min。

2.2 檢測波長的選擇 婆婆納供試品溶液進樣后經(jīng)二極管陣列檢測器檢測并儲存全部光譜 （190～400 nm），3D光譜圖顯示在190 nm處對照品桃葉珊瑚苷有最大吸收，經(jīng)光譜等高線分析優(yōu)化檢測條件，選擇203 nm為檢測波長，雜質(zhì)干擾更少。

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌?12.69、11.65、5.45 mg，置25 mL棕色量瓶中，用流動相溶解并定容，搖勻，分別制成含梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷Ⅱ0.507 6、0.466、0.218 mg/m L的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液適量，置10 m L量瓶中，加流動相定容，搖勻，制成含梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷Ⅱ50.76、46.6、10.9μg/mL的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 取婆婆納藥材粉末 （過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）60 min，放冷，用10%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液5 mL，蒸干，以流動相溶解定容到5 mL，0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.5 流動相的選擇 參考文獻，以不同比例的乙腈-水為流動相，在Gemini C18色譜柱 （110?，4.60 mm×250 mm，5μm）上進行試驗，結(jié)果乙腈（A）-水 （B）梯度洗脫 （0～13 min，3%A；13～20 min，3%～15%A；20～50 min，15%A；50～60 min，15%～21%A；60～70 min，21%A；70～110 min，21%～100%A），柱溫25℃；體積流量1.0 mL/min時達到滿意的分離效果（見圖1）。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 精密吸取供試品溶液10 μL注入液相色譜儀。結(jié)果以桃葉珊瑚苷計理論塔板數(shù)15 371，分離度1.46，對稱因子0.97。

2.6.2 方法專屬性即峰純度檢查 為檢查樣品HPLC色譜峰是單個還是多個成分，采用二極管陣列檢測器對主峰梓醇、桃葉珊瑚苷和胡黃連苷Ⅱ的峰純度進行檢查。結(jié)果純度因子均大于995.00（閾值）。

圖1 對照品及婆婆納樣品HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and V.eriogyne H.W ink l sam p le

2.6.3 線性關(guān)系 分別精密吸取 “2.3”項下的對照品溶液2、5、10、20、50、100μL注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積 （A）為縱坐標、進樣量 （M，μg）為橫坐標，進行線性回歸，得梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷Ⅱ線性回歸方程分別為A=770.0M+8.785（r=0.999 9），線性范圍0.101 5～5.076μg；A=861.2 M+7.858（r= 0.999 9），線性范圍0.093 2～4.66μg；A=2 737 M+0.063（r=0.999 9），線性范圍0.021 8～1.09 μg。線性關(guān)系良好。

2.6.4 精密度試驗 精密吸取 “2.3”項下的對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷Ⅱ峰面積RSD分別為0.02%，0.03%，0.08%，表明儀器精密度良好。

2.6.5 重復(fù)性試驗 取同批樣品粉末共6份，每份約0.5 g，精密稱定，按供試品溶液的制備和測定方法操作測定，結(jié)果梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷ⅡRSD分別為1.4%、0.7%、1.7%，可見該方法重復(fù)性良好。

2.6.6 穩(wěn)定性試驗 取本品粉末約0.5 g，按供試品制備方法制備樣品液，分別于配制后0、2、4、8、12 h，取10μL注入液相色譜儀，考察樣品峰面積的變化。結(jié)果12 h內(nèi)，峰面積變化很小，梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷Ⅱ峰面積RSD分別為1.9%、0.4%、0.6%，表明供試品溶液及方法穩(wěn)定性良好。

2.6.7 準確度試驗和范圍考察 結(jié)合范圍的考察進行準確度試驗。因12批婆婆納藥材中桃葉珊瑚苷的質(zhì)量分數(shù)為0.6‰～7.5‰，平均值3.0‰，均值的40%約為1.2‰，按 “2.4”項和 “2.6.8”項下操作，注入液相色譜儀的桃葉珊瑚苷量約0.22μg，所以設(shè)計范圍的低限值為0.2μg左右；均值的6倍約為18.0‰，按供試品溶液的制備和定量測定方法操作，注入液相色譜儀的桃葉珊瑚苷量約3.2μg，所以設(shè)計范圍的高限值為3.5μg左右；結(jié)合準確度試驗，取兩個不同質(zhì)量 （0.03 g，0.6 g）的同批樣品粉末各6份，共12份，精密稱定，分別精密加入一定量的梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤?，分別測定在范圍低限值和高限值處的加樣回收率，結(jié)果見表1～3。

表1 梓醇的加樣回收率Tab.1 Results of recovery tests for catalpol

表2 桃葉珊瑚苷的加樣回收率Tab.2 Results of recovery tests for aucubin

由以上實驗結(jié)果可見：桃葉珊瑚苷和梓醇、胡黃連苷Ⅱ分別在0.18～3.6μg，0.12～2.1μg，0.034～0.7μg（高低限值分別對應(yīng)按 “2.4”項和“2.6.8”項下操作，注入HPLC儀測定的量）范圍內(nèi)能準確測定。

表3 胡黃連苷Ⅱ的加樣回收率Tab.3 Results of recovery tests for picrosideⅡ

2.6.8 樣品測定 按上述方法，分別精密吸取對照品溶液10μL與供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果見表4。

表4 不同來源婆婆納藥材中梓醇、桃葉珊瑚苷、胡黃連苷Ⅱ的質(zhì)量分數(shù)（n=2）Tab.4 Contents of catalpol，aucubin and p icrosideⅡin V.eriogyne H.W ink l（n=2）

3 討論

分別考察了甲醇、50%乙醇、10%乙醇、流動相 （乙腈-水3：97）、水等不同提取溶劑；超聲、回流等不同提取方式；并進行了提取時間為15、30、60 min，提取次數(shù)為1次、2次，提取溶劑用量為20、50、100倍藥材量的考察。結(jié)果表明，以50倍藥材量的10%乙醇超聲60 min，1次即基本提取完全，與回流提取結(jié)果相差很小，因此本實驗采用該提取方法。

由測定結(jié)果可知，不同產(chǎn)地婆婆納中梓醇、桃葉珊瑚苷和胡黃連苷Ⅱ的含有量差別顯著，高低差異近10倍之多，說明藥材產(chǎn)地的不同環(huán)境和土壤條件或采收季節(jié)的差異對藥材內(nèi)在活性成分影響顯著。現(xiàn)有標準都沒有對婆婆納中活性成分定量測定提出要求，因此制訂科學(xué)合理的婆婆納成分測定方法，控制藥材質(zhì)量勢在必行。本研究建立的測定方法簡便易行，結(jié)果準確可靠，為探索制訂完善的婆婆納藥材質(zhì)量標準提供了依據(jù)。

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Simultaneous determ ination of three iridoid glycosides from Veronica eriogyne H.W ink l by HPLC

CUIHong-mei*， LUO Heng， YANG Jun， YANG An-dong

（Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China）

AIMTo develop a method for determining catalpol，aucubin and picrosideⅡfrom Veronica eriogyne H.Winkl collected from Tibet and Si'chuan Province by HPLC.METHODSExternal standard method and the chromatographic Gemini C18 Column（110?，4.60 mm×250 mm，5μm）were adopted with mobile phase consisting of acetonitrile（A）-water（B）in a gradient elution manner.The detected wavelength was set up at 203 nm and column temperaturewasmaintained at25℃.RESULTSThe linear rangeswere 0.101 5-5.076 μg for catalpol，0.093 2-4.66μg for aucubin，and 0.043 6-2.18μg for picrosideⅡ，respectively.The average recoveries of catalpol，aucubin and picrosideⅡwere 98.9%（RSD 1.0%），103.8%（RSD 0.7%）and 98.8%（RSD 1.9%），respectively.CONCLUSIONThe differences of contents of three constituents from V. eriogyne H.Winkl collected from ten growing areas are large，almost tenfold.

Veronica eriogyne H.Winkl；catalpol；aucubin；picrosideⅡ；iridoid glycoside；HPLC

R284.1

A

1001-1528（2015）04-0810-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.025

2014-06-06

四川省科技廳基本科研業(yè)務(wù)專項基金資助項目 （A-2014N-10）

崔紅梅 （1973—），女，助理研究員，從事中藥化學(xué)和質(zhì)量評價研究。Tel：13551123569，E-mail：245416698@qq.com