沈璇 黃繼錦 張雪 范芳 李長福

（遵義醫(yī)學(xué)院生化教研室，貴州 遵義563099）

Hedgehog是編碼一系列分泌蛋白的基因家 族，最早是在果蠅胚胎體中被發(fā)現(xiàn)［1］。Hedgehog信號通路是一種非常保守的經(jīng)典的信號通路，在胚胎的細(xì)胞生長和分化過程中起重要的作用［2］。細(xì)胞的生長與增殖受Hedgehog信號通路控制，而細(xì)胞生長增殖的失控則是腫瘤發(fā)生的一個過程。在人類細(xì)胞中，Hedgehog信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由Hedgehog配體、Patched蛋白受體、Smothened跨膜受體、轉(zhuǎn)錄因子Gli等關(guān)鍵成分構(gòu)成［3］。目前大量的研究表明，Hedgehog信號通路的異常激活與腫瘤發(fā)生有關(guān)，抑制該通路的藥物已用于治療肺癌等腫瘤，Hedgehog信號通路對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號通路可能通過激活肝癌細(xì)胞中下游靶基因異常表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲、自噬、抗輻射等肝癌形成及發(fā)展過程［4］。近來，Arzumanyan等［5］發(fā)現(xiàn)HBx蛋白可反式激活肝癌細(xì)胞的Shh信號通路，其表達(dá)水平與Gli2密切相關(guān)。Kim等［6］發(fā)現(xiàn)HB x蛋白能通過相互結(jié)合的方式增強(qiáng)Gli1的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，并與Gli1的核定位有關(guān)。Hedgehog信號通路與HBV密切相關(guān)，但對于它們是否協(xié)同調(diào)節(jié)HBV相關(guān)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移等過程，目前仍未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2.2.15細(xì)胞株（中國典型培養(yǎng)物保藏中心），DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco公司），Trizol試劑（Invitrogen公司），PCR引物由上海生工合成。實時熒光定量PCR試劑盒（TakaRa公司），EDU檢測試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 細(xì)胞以1×105個／mL濃度種于96孔板中，培養(yǎng)24h，同步化24h，邊緣用滅菌PBS填滿。分別用含5μmol／L、15μmol／L、25μmol／L濃度環(huán)耙明的完全培養(yǎng)液作用，孵育24h、48h及72h后加入20μL 濃度5mg／mL的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后終止培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)基，加入150μL DMSO，置搖床上低速震蕩10min，待結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀OD490nm處檢測各孔的吸光值。同時設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO）、對照孔（脂質(zhì)體處理組、質(zhì)粒空載體處理組），每組做3個平行。

1.2.2 EDU法檢測細(xì)胞DNA合成情況 實驗分組同上，用5μmol／L、15μmol／L、25μmol／L濃度環(huán)耙明處理24h、48h及72h后，加入含有EDU試劑的培養(yǎng)基孵育2h。去培養(yǎng)基，加入細(xì)胞固定液（4%多聚甲醛）室溫脫色搖床孵育30min后用PBS溶液漂洗3次，滴加0.5%Triton X-100浸泡細(xì)胞，染色反應(yīng)液500μL，常溫避光條件下孵育30min，加Hoechst染料后再孵育30min，PBS沖洗3次，風(fēng)干后封片。倒置熒光顯微鏡下拍照后統(tǒng)計DAPI標(biāo)記的總細(xì)胞數(shù)和EDU標(biāo)記有DNA合成的細(xì)胞數(shù)，DNA合成率 ＝EDU標(biāo)記有DNA合成的細(xì)胞數(shù)／DAPI標(biāo)記的總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 Real-time PCR法檢測細(xì)胞 Gli1mRNA 表達(dá)情況 實驗分組同上，細(xì)胞處理48h后，收集各孔細(xì)胞，用Trizol法提取RNA，在37℃15min，85℃5s條件下反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再將cDNA進(jìn)行 Real-time PCR，引物如下。Gli1上游引物：5′-CA-GCTAGAGTCCAGAGGTTCAAGAG-3′，下游引物：5′-GTGAGTAGA-CAGAGGTTGGGAGGT-3′，擴(kuò)增片段長度為108bp。β-actin上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物：5′-ACGAAGATCCGCCTG - ATACTGAATC-3′，擴(kuò)增片段長度為232bp。經(jīng)Real-timePCR反應(yīng)儀器檢測，在擴(kuò)增效率相同的基礎(chǔ)上，通過公式2－（△△CT）計算得到目的基因相對表達(dá)量。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 以上實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，資料經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗后，行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗法。P＜0.05示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)24h，用倒置顯微鏡觀察并拍照。低倍鏡下可見細(xì)胞貼壁生長，且成片地“抱團(tuán)”生長，形態(tài)通透、舒展呈多邊形或梭形（圖1A）；高倍鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)有許多空泡狀病毒顆粒（圖1B）。

圖1 A 低倍鏡下（40×）Hep G2.2.15細(xì)胞

圖1 B 高倍鏡（100×）Hep G2.2.15細(xì)胞

2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果（表1，圖2）顯示：5μmol／L濃度組各個時間段與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；15μmol／L濃度組在48h后與空白對照組存在差異（P＜0.05），48h、72h的生長抑制率分別為79.62%、75.10%；25μmol／L 濃度組的細(xì)胞生長抑制率在24h、48h及72h分別為68.9%、31.76%、23.66%，與空白組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在各個時間段內(nèi)，環(huán)耙明濃度越高，HepG2.2.15細(xì)胞活率越低。

表1 不同濃度環(huán)耙明處理后HepG2.2.15細(xì)胞的增殖情況（±s，n＝3）

表1 不同濃度環(huán)耙明處理后HepG2.2.15細(xì)胞的增殖情況（±s，n＝3）

注：＊P＜0.05

組別24h 48h 72h空白照1.241±0.028 1.757±0.1295 1.695±0.100 5μmol／L 1.290±0.058 1.494±0.1366 1.580±0.057 15μmol／L 1.205±0.065 1.399±0.075＊ 1.273±0.06＊25μmol／L 0.845±0.139 0.5583±0.028＊ 0.401±0.079＊

圖2 不同濃度環(huán)耙明處理后HepG2.2.15細(xì)胞的增殖情

2.3 EDU法檢測細(xì)胞DNA合成情況

結(jié)果（圖3）顯示，DNA合成百分比5μmol／L濃度組在72h后與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；15μmol／L濃度組在48h及72h與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；25μmol／L濃度組在24h、48h及72h時間點(diǎn)上均低于空白組 （P＜0.05）。由實驗結(jié)果可知，環(huán)耙明能在較高濃度時抑制細(xì)胞的DNA合成。

圖3 各組HepG2.2.15細(xì)胞的DNA合成

2.4 Real-timePCR檢測Gli1mRNA表達(dá)情況

Real-timePCR結(jié)果（表2，圖4）顯示：隨著環(huán)耙明濃度的增加，Gli1mRNA的表達(dá)逐漸降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各組間差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明環(huán)耙明在HepG2.2.15細(xì)胞中具有劑量效應(yīng)。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，Gli1mRNA表達(dá)水平的Pearson相關(guān)系數(shù)為98.8，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組HepG2.2.15細(xì)胞的Gli1 mRNA表達(dá)（±s，n＝3）

表2 各組HepG2.2.15細(xì)胞的Gli1 mRNA表達(dá)（±s，n＝3）

注：＊P＜0.05

分組 β-actin（Ct value）Gli1（Ct value）Fold Change（2－△△Ct）空白組17.95±0.047 34.502±0.211 1.000±0.000 5μmol／L 17.224±.143 34.792±0..078 0.496±0.028＊15μmol／L 17.365±0.087 35.287±0.106 0.388±0.022＊25μmol／L 17.323±0.079 35.918±0.102 0.243±0.018＊

圖4 不同濃度環(huán)耙明處理組細(xì)胞Gli1mRNA相對表達(dá)量

3 討 論

原發(fā)性肝癌在惡性腫瘤中發(fā)病率位居全球第三位，死亡率居第二位，嚴(yán)重威脅人類的身體健康［7］。目前，對肝癌治療的手段中，針對肝癌發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵分子進(jìn)行分子藥物靶向干預(yù)的生物治療展現(xiàn)了良好的前景。

Hedgeheg信號通路與腫瘤的分化及抗凋亡、遷移等發(fā)病機(jī)制有著密切的關(guān)系。在臨床治療中，使用Hedgehog信號通路抑制劑作為藥物治療已經(jīng)成為一種重要的輔助手段［8］。在體外實驗研究中，沉默Hedgehog的方法很多，其中使用環(huán)耙明阻斷Hedgehog信號通路已被廣泛應(yīng)用［9－12］。因此，本實驗在表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞中用一定濃度環(huán)耙明阻斷Hedgehog信號通路；用MTT及EDU檢測肝癌細(xì)胞的增殖能力。MTT實驗結(jié)果顯示，隨著環(huán)耙明濃度的提高，HepG2.2.15細(xì)胞活性逐漸降低，其中25μmol／L濃度環(huán)耙明處理組與空白組各時段差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。EDU實驗結(jié)果顯示25μmol／L濃度環(huán)耙明處理組的DNA合成率在各個檢測時間點(diǎn)上均低于對照組。MTT的結(jié)果與EDU法得出環(huán)耙明對HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響基本一致，提示Hedgehog信號通路參與了對 HepG2.2.15細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)過程。在HepG2.2.15細(xì)胞中，抑制 Hedgehog信號通路的活性能降低細(xì)胞的增殖能力，其機(jī)制可能與HepG2.2.15細(xì)胞中Gli1的表達(dá)水平下降有關(guān)。Hedgehog信號通路對肝癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮了重要作用，其高活化程度與肝癌惡化及預(yù)后差有著緊密的聯(lián)系。肝癌發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，找出Hedgehog信號通路活化的原因十分必要，對其作進(jìn)一步深入研究，將給肝癌的治療提供必要的理論依據(jù)。

［1］ Lee JJ，Von Kessler DP，Parks S，et al.Secretion and locaized transcription suggest a role in positional signaling for products of the segmentation gene hedgehog［J］.Cell，1992，71（1）：33-50.

［2］ Ingham PW，McMahon AP.Hedgehog signaling in animal development：Paradigms and principles［J］.Genes Dev，2001，15（23）：3059-3087.

［3］ Zhu SL，Luo MQ，Peng WX，et al.Sonic hedgehog signalling pathway regulates apoptosis through Smo protein in human umbilical vein endothelial cells［J］.Rheumatology（Oxford），2014，17：421.

［4］ Zheng X，Yao Y，Xu Q，et al.Evaluation of gliomaassociated oncogene 1expression and its correlation with the expression of sonic hedgehog，E-cadherin and S100a4in human hepatocellular carcinoma［J］.Molec-ular Medicine Reports，2010，3（6）：965-970.

［5］ Sicklick JK，Li YX，Jayaraman A，et al.Dysregulation of the Hedgehog pathway in human hepatocarcinogenesis［J］.Carcinogenesis，2006，27（4）：748-757.

［6］ 劉揚(yáng)，吳金明.原發(fā)性肝癌發(fā)病的分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)新知雜志，2009，19（2）：109-117.

［7］ Xiao H，Cheng S，Tong R，et al.BAG3regulates epithelial-mesenchymal transition and angiogenesis in human hepatocellular carcinoma［J］.Lab Invest，2014 ，94（3）：252-261.

［8］ 潘登，李艷.Hedgehog-Gli信號通路與腫瘤［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011，19（3）：591-595.

［9］ Von Hoff D D，LoRusso P M，Rudin C M，et al.Inhibition of the hedgehog pathway in advanced basal-cell carcinoma［J］.New England Journal of Medicine，2009，361（12）：1164-1172.

［10］ Tremblay M R，Lescarbeau A，Grogan M J，et al.Discovery of a potent and orally active hedgehog pathway antagonist（IPI-926）［J］.Journal of medicinal chemistry，2009，52（14）：4400-4418.

［11］ Taipale J，Chen J K，Cooper M K，et al.Effects of oncogenic mutations in Smoothened and Patched can be reversed by cyclopa mine［J］.Nature，2000，406（6799）：1005-1009.

［12］ Rudin CM，Von Hoff DD，LoRusso PM，et al.Updated safety and efficacy data from a first-in-human，first-in-class phase I study of Hedgehog pathway antagonist GDC-0449［J］.Eur J Cancer，2008，6：112-112.

［13］ Chari NS，McDonnell TJ.The sonic hedgehog signaling network in development and neoplasia［J］.Adv Anat Pathol，2007，14：344-352.

［14］ Inaguma S，Riku M，Hashimoto M，et al.GLI1interferes with the DNA mismatch repair system in pancreatic cancer through BHLHE41-mediated suppression of MLH1［J］.Cancer Res，2013，73：7313-7323.

［15］ Xu Q，Liu X，Zheng X，et al.The transcriptional ac

tivity of Gli1is negatively regulated by AMPK through Hedgehog partial agonism in hepatocellular carcinoma［J］.Int J Mol Med，2014 ，34（3）：733-741.