方 波 慈 元 宗 剛

大連市第二人民醫(yī)院，遼寧大連 116000

超深低溫冷凍與碳化二亞胺交聯(lián)的同種異體肌腱修復兔跟腱損傷的實驗研究

方 波 慈 元 宗 剛

大連市第二人民醫(yī)院，遼寧大連 116000

目的尋找一種新的方法對同種異體肌腱進行進一步的預處理來改善其修復效果，為臨床應用提供實驗基礎和理論依據(jù)。方法采用超深低溫冷凍法獲得兔同種異體肌腱，應用碳化二亞胺對其進行交聯(lián)并肝素化，檢測其組織相容性；將交聯(lián)組和未交聯(lián)組肌腱對兔跟腱損傷進行修復，觀察并對比不同時間段兩組的腱骨愈合情況。結果1、4周EDC交聯(lián)組炎癥反應分級（Ⅰ～Ⅱ）均較未交聯(lián)組（Ⅲ～Ⅳ）輕，差異有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.020、0.030)；移植實驗可見交聯(lián)并肝素化的肌腱在修復跟腱損傷中的愈合能力比未交聯(lián)的肌腱強，Sharpey’s纖維出現(xiàn)早，縮短了腱骨愈合時間。結論經超深低溫冷凍和EDC交聯(lián)共同處理肌腱，增強其穩(wěn)定性,降低了同種異體肌腱的免疫原性，促進肌腱與骨的愈合。

同種異體肌腱；超深低溫冷凍；碳化二亞胺；移植

目前運動損傷、交通意外造成的跟腱損傷明顯增多，處理這類損傷目前主要采用自體肌腱移植重建。由于自體肌腱取材時會造成一定程度的副損傷，且自體組織來源有限，使得同種異體肌腱的研究得以快速發(fā)展。而同種異體肌腱移植成功的關鍵是如何降低或抑制移植物的抗原性。該實驗通過超深低溫冷凍及應用碳化二亞胺處理肌腱以探求其降低同種異體肌腱抗原性的可能性，為進一步開展臨床研究奠定基礎，報道如下。

1 實驗方法

1.1 同種異體肌腱的制備

實驗于2011—2013年之間進行，取新西蘭大白兔稱重，按30 mg/kg用戊巴比妥鈉靜脈麻醉，無菌條件下取兔肌腱，生理鹽水反復沖洗浸鮮肌腱置入由10%二甲基亞砜及純小牛血清組成的冷凍保護液中,室溫下平衡后置入液氮罐氣液面6 h，再浸入液氮中貯存3個月。復蘇:40℃水浴快速復溫,含10%FCS的RPMI 1640液洗滌去除冷凍保護劑后在室溫下浸泡在3%過氧化氫中3h后，用蒸餾水反復沖洗3次，30 min/次。將其放入1：1氯仿和甲醛混合溶液中脫脂 4 h,用蒸餾水反復沖洗 3次，30 min/次。真空冷凍干燥，環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.2 同種異體肌腱的交聯(lián)并肝素化

肌腱用50 mmol/L MES緩沖液浸泡24 h，與EDC交聯(lián)液（含50 mmol/L MES,5 mmol/L EDC,5mmol/L NHS,用40%乙醇配制），室溫交聯(lián)6 h后，95%乙醇漂洗2次，30 min/次,PBS漂洗2次共24 h，Hepes緩沖液漂洗4次，20 min/次。真空冷凍干燥后,環(huán)氧乙烷消毒備用。

1.3 免疫原性實驗

選取雄性SD大鼠40只,體重為(250±20)g。實驗前背部剃毛,常規(guī)消毒,按0.35 mL/kg的水合氯醛進行腹腔內注射麻醉動物。實驗分兩組,每組20只。各組脊背皮下分別埋置上述兩組肌腱（1組為EDC交聯(lián)，2組為未處理組），3～0絲線縫合傷口,定期換藥。分別于術后第1、4周以脫頸法個處死老鼠 10只，取大鼠皮下埋藏組織活檢,HE染色觀察移植大鼠皮下后的免疫反應。觀察炎性反應分級[1]I級為試樣周圍未見或僅見少量淋巴細胞；II級為試樣周圍可見少量淋巴細胞；III級為試樣周圍可見少量嗜中性粒細胞、淋巴細胞浸潤和巨細胞反應；Ⅳ級為試樣周圍可見以嗜中性粒細胞浸潤為主的炎癥反應，可見吞噬細胞。

1.4 同種異體肌腱移植

采用成年兔30只，隨機分為兩組，分別于雙側跟腱止點處切斷[2]。1組為采用未處理的同種異體肌腱進行修復，2組采用超深低溫冷凍及EDC交聯(lián)并肝素化的同種異體肌腱移植進行修復。術后分別于1、3、6個月處死動物，取材作光鏡和掃描電鏡。

1.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件實現(xiàn)，體內組織相容性實驗的統(tǒng)計分析采用χ2檢驗。

2 實驗結果

2.1 結果

①實驗動物全部成活，手術切口均無感染和移植物排出。未交聯(lián)組埋植于大鼠皮下組織1周，光鏡下見肌腱變得疏松，纖維間隙增大，部分纖維變得模糊，基質周圍組織水腫，大量炎癥細胞浸潤,炎癥反應分級多為III～Ⅳ級，見圖1。

圖1 未交聯(lián)組1周

②4周時，纖維組織大部分纖維碎裂，降解，正常的纖維排列結構消失，組織水腫消退，炎癥細胞浸潤減輕，但少量炎癥細胞內部浸潤，炎癥反應分級多為II～III級，見圖2。

圖2 未交聯(lián)組4周

③EDC交聯(lián)并肝素化組埋于大鼠皮下后，1周取材表現(xiàn)為均質致密結構，周圍炎癥反應輕微，鏡下見炎癥細胞浸潤，炎癥反應分級I～III級，見圖3。

圖3 交聯(lián)組1周

④4周取材時，結構仍為均質致密的纖維排列，但纖維間有大量的與纖維走行一致的細胞浸潤，同時在其周圍有大量的新生毛細血管形成。炎癥反應分級為I～II級，見圖4。

圖4 交聯(lián)組4周

⑤對4周取材的標本切片進行α-SMA免疫組化染色，可見EDC交聯(lián)并肝素化的同種異體肌腱內部不均勻的棕黃色片狀染色區(qū)域，提示其內部有表達α-SMA的細胞浸潤多數(shù)為血管內皮細胞，見圖5、6。

圖5 α-SMA免疫組化染色

圖6 α-SMA免疫組化染色

⑥數(shù)據(jù)表明1、4周EDC交聯(lián)組炎癥反應分級均較未交聯(lián)組輕，χ2值分別為13.6、14.6，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。見表1。

表1 炎癥反應分級

2.2 同種異體肌腱移植

2.2.1 組織學觀察 術后1個月未處理組在肌腱于骨之間可見明顯縫隙，存在少量的疏松結締組織，見圖7。

圖7 未交聯(lián)組手術后1個月

實驗組肌腱和骨之間出現(xiàn)致密的結締組織，可見少量排列紊亂的Sharpey’s纖維,但未愈合，見圖8。

術后3個月未處理組在肌腱與骨之間出現(xiàn)排列無序的Sharpey’s纖維，有疏松結締組織填充，但部分移植肌腱與骨之間仍有分離，以隧道內口較明顯，見圖9。

圖8 交聯(lián)組術后1個月

圖9 未交聯(lián)組術后3個月

實驗組肌腱與骨隧道之間出現(xiàn)較多的排列有序的Sharpey’s纖維，并見纖維軟骨填充，但無鈣化軟骨形成，見圖10。

圖10 交聯(lián)組術后3個月

術后6個月未處理組在肌腱與骨之間出現(xiàn)較多的Sharpey’s纖維，部分排列有序，并出現(xiàn)纖維軟骨填充，見圖11。

圖11 未交聯(lián)組術后6個月

實驗組隧道有較多的鈣化軟骨，隧道中部、外部可見明顯的肌腱纖維、纖維軟骨、鈣化軟骨、骨 4層結構，形成直接連接，部分區(qū)域如肌腱末端等結構相似，組織均勻，難以分辨清楚，見圖12。

圖12 交聯(lián)組術后6個月

2.2.2 電鏡 掃描電鏡發(fā)現(xiàn)術后1個月，經超深低溫冷凍及EDC交聯(lián)的同種異體肌腱與骨的交界區(qū)纖維組織和骨組織間可見排列不規(guī)則的類膠原纖維樣組織，在切面可見大量的紅細胞存在，證明此區(qū)血管豐富，見圖13。

圖13 交聯(lián)術后1個月

3個月時，交界區(qū)仍可見肌腱纖維排列紊亂，并有部分機化，有大量排列不規(guī)則的類膠原纖維，但界限不清，成骨的功能強，愈合能力強，可見成纖維細胞順纖維走形嵌入，見圖14。

圖14 交聯(lián)術后3個月

6個月時，交界區(qū)內可見，排列有一定的方向性的類膠原纖維，可見血管組織，并有大量的成纖維細胞和纖維母細胞，見圖15。

圖15 交聯(lián)術后6個月

3 討論

同種異體肌腱的預處理方式主要有冷凍、凍干和化學處理3種[3]，目前，冷凍處理是國內、外公認處理肌腱抗原性有效的方法。冷凍包括低溫、深低溫及超深低溫，但降低肌腱抗原性,減輕免疫排斥反應同時使其抗張強度顯著降低,且愈合過程完全依賴于外源性愈合,易產生嚴重粘連,影響術后效果[4]，且仍有較低的抗原性，存在潛在的風險。肌腱的化學處理主要采用低毒性的EDC，其作用機制是是“零長度交聯(lián)”，在膠原間形成交聯(lián)的同時，并不引入新的物質，降低抗原性的同時保持肌腱的生物穩(wěn)定性[5-6]。該實驗采用超深低溫冷凍和EDC交聯(lián)共同處理肌腱，尋求一種新的可行的降低抗原性提高生物穩(wěn)定性的方法。

同種異體肌腱移植目前主要的問題有1肌腱的免疫反應問題2肌腱愈合問題。谷守濱等[7]研究表明：EDC交聯(lián)同種異體肌腱能夠降低其抗原性，增加其抗酶降解的能力，且無明顯的細胞毒性。靳憲輝等[8-9]應用碳化二亞胺交聯(lián)改性的脫細胞豬肌腱成功修復兔跟腱缺損，表明EDC交聯(lián)同種異體肌腱有組織相容性好、移植排斥反應輕、生物力學性能強的優(yōu)點。該研究免疫原性實驗中發(fā)現(xiàn)EDC交聯(lián)組肌腱鏡下觀察結構仍為均質致密的纖維排列，但纖維間有大量的與纖維走行一致 的細胞浸潤，同時在其周圍有大量的新生毛細血管形成。炎癥反應分級為I-II級，較未交聯(lián)組輕微。表明經超深低溫冷凍和EDC交聯(lián)共同處理肌腱具有低抗原性和良好的生物穩(wěn)定性。肌腱與骨的愈合的特征是骨隧道內移植物與骨面間出現(xiàn)Shapery纖維。該實驗通過移植物光鏡下發(fā)現(xiàn)交聯(lián)組在術后1個月出現(xiàn)Sharpey’s纖維，但量少且排列紊亂；3個月肌腱與骨隧道之間出現(xiàn)較多的排列有序的Sharpey’s纖維，并見纖維軟骨填充，將肌腱與骨連接起來；6個月時隧道有較多的鈣化軟骨，隧道中部、外部可見明顯的肌腱纖維、纖維軟骨、鈣化軟骨、骨四層結構，形成直接連接。然而，未交聯(lián)組Sharpey’s纖維，出現(xiàn)較晚?？梢娊洺畹蜏乩鋬龊虴DC交聯(lián)共同處理肌腱愈合能力比未交聯(lián)的肌腱強，縮短了腱骨愈合時間。

該文通過動物實驗驗證超深低溫冷凍和EDC交聯(lián)同種異體肌腱修復跟腱損傷的優(yōu)越性，將其作為制備同種異體肌腱預處理步驟的提供了新的思路，其生物力學特性還有待進一步研究。

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Empirical Study of Rabbit's Tendon Allograft Obtained by Ultra-deep Frozen and Cross-linked by EDC/NHS Repairing Injure of Achilles Tendon

FANG BoCI Yuan ZONG Gang
Second People's Hospital of Dalian City,Dalian,Liaoning Province,116000,China

ObjectiveTo find a new way to improve the repairing effect by further pretreating tendon allograft so as to provide an experimental basis and theory evidence for clinical application.MethodsThe rabbit's tendon allograft was obtained by ultra-deep frozen then cross-linked and heparinized by EDC/NHS and detected histocompatibility.Injure of rabbit achilles tendon was repaired by the tendon allograft of management and nulli-management.The aim was to observe and contrast tendon-bone healing of two sets in the different time.ResultsEDC crosslinking group grade inflammation(Ⅰ～Ⅱ)was lighter than those of uncross-linked group(Ⅲ～Ⅳ)at 1 or 4 weeks，the difference was statistically significant(P values were 0.020,0.030);the transplantation showed that the capability of agglutination of the tendon allograft of management was more powerful than nulli-management set on repairing injure.The time of Sharpey's fibers appearing was earlier,and the cross-linking and heparinization process can shorten tendon-bone healing time.ConclusionTendon allograft obtained by ultra-deep frozen and cross-linked by EDC/NHS reinforces its constancy and reduces immunogenicity as well as promotes tendon-bone healing.

Tendon allograft;Ultra-deep frozen;Carbodiimide;Transplant

R686.1

A

1674-0742（2015）03（a）－0016-04

2014-11-25）

方波（1982.6-），男，吉林人，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事脊柱外科研究工作。