任衛(wèi)高， 楊 洋， 葛少波， 裴燕芳， 章 冠， 潘金火

（南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210023）

清肺消痤凝膠提取物平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)的測定

任衛(wèi)高， 楊 洋， 葛少波， 裴燕芳， 章 冠， 潘金火*

（南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210023）

目的測定清肺消痤凝膠提取物及其指標成分在不同溶劑中的平衡溶解度和不同pH下的表觀油水分配系數(shù)，為其經(jīng)皮給藥研究提供依據(jù)。方法采用沉淀法測定提取物的溶解度，以指標成分法測定大黃酚、黃芩苷和小檗堿在不同溶劑中的平衡溶解度以及在正辛醇/水和正辛醇/緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果37℃時提取物在丙酮和乙醇中的溶解度較大，而在PBS緩沖體系中的溶解度呈先減小后增大的趨勢，大黃酚、黃芩苷和小檗堿在PBS緩沖液中的溶解度均隨pH的增大而增大；大黃酚的表觀油水分配系數(shù)在pH 5.12時達到最大，黃芩苷和小檗堿的油水分配系數(shù)隨pH增大而減小。結(jié)論清肺消痤凝膠提取物在中等極性的溶劑中溶解性較好，pH對于提取物的表觀油水分配系數(shù)有較大影響，可通過調(diào)節(jié)pH來增加藥物的經(jīng)皮吸收。

平衡溶解度；表觀油水分配系數(shù)；大黃酚；黃芩苷；小檗堿

清肺消痤凝膠處方最早源于 《醫(yī)宗金鑒》之 “顛倒散”，在長期的臨床實踐中經(jīng)化裁而成，具有清肺解毒、化濕消腫、祛瘀散結(jié)的功效，主治肺經(jīng)血熱及濕熱瘀滯之痤瘡。該方主要由大黃、黃芩、黃柏、硫磺等藥味組成，處方提取物中大黃酚、黃芩苷和小檗堿分別是君藥和臣藥中的主要藥效成分，本實驗以上述三者的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)結(jié)合沉淀法測定提取物溶解度，綜合評價提取物的理化性質(zhì)，以期為清肺消痤凝膠經(jīng)皮給藥新劑型提供理論依據(jù)［1-5］。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀，Waters-2998紫外檢測器，Empower色譜工作站；色譜柱為HederaODS-2柱（江蘇漢邦科技有限公司）；AG135型電子天平 （瑞士梅特勒公司）；FA1104N電子分析天平 （上海精密科學儀器有限公司）；AS20500A超聲清洗器 （天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；TDZ4-WS臺式低速離心機 （長沙湘儀離心機儀器有限公司）；DKZ-2型電熱恒溫震蕩水槽 （上海精宏實驗設備有限公司）；PHS-3型pH計 （上海儀電科學股份有限公司）。

大黃酚對照品 （批號0796-200208，供含量測定用）、黃芩苷對照品 （批號0715-200212，供含量測定用）、鹽酸小檗堿對照品 （批號0713-9906，供含量測定用）均購自中國食品藥品檢定研究院；磷酸 （南京化學試劑有限公司）；氫氧化鈉 （汕頭市西隴化工廠有限公司）；正辛醇（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；清肺消痤凝膠提取物 （自制，批號20140113）；甲醇 （色譜純，山東禹王試劑有限公司）、乙腈 （色譜純，美國天地試劑公司），水為雙蒸水，乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷均為分析純。

2 成分定量測定方法的建立

2.1 大黃酚測定

2.1.1 色譜條件 按照 《中國藥典》2010年版一部大黃項下，HederaODS-2色譜柱，流動相為甲醇-0.1%磷酸（85∶15），體積流量1 mL/min，柱溫35℃，檢測波長254 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱定大黃酚對照品2.4mg至100 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為24μg/mL的大黃酚對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取提取物0.1 g，置于10 mL的量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45 μm濾膜，即得。

2.1.4 陰性供試品溶液的制備 制備缺大黃的清肺消痤凝膠提取物，精密稱取0.1 g，置于10 mL的量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45μm濾膜，即得。

2.1.5 標準曲線的繪制 精密吸取一定量上述大黃酚對照品溶液，按倍數(shù)關系稀釋成6種不同質(zhì)量濃度的溶液，分別吸取10μL，記錄色譜峰積分面積。以各大黃酚對照品質(zhì)量濃度為橫坐標 （X），相應的對照品峰面積積分值為縱坐標 （Y），進行回歸處理，得回歸方程：Y=14 772X-36 695，r=0.999結(jié)果表明，大黃酚在1.2～24μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.6 專屬性考察 精密量取大黃酚對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10μL，按照 “2.1.1”項下色譜方法測定。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上有相同保留時間的色譜峰，而陰性樣品色譜在此保留時間無干擾，證明本法可行。

2.2 黃芩苷測定

2.2.1 色譜條件 按照 《中國藥典》2010年版一部黃芩項下，色譜柱HederaODS-2柱，流動相為甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2），體積流量1 mL/min，柱溫35℃，檢測波長280 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定黃芩苷對照品3.36 mg至50 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為67.2μg/mL的黃芩苷對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取提取物0.1 g，置于10 mL的量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45 μm濾膜，即得。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備 制備缺黃芩的清肺消痤凝膠提取物，精密稱取0.1 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45μm濾膜，即得。

2.2.5 標準曲線的繪制 精密吸取一定量上述黃芩苷對照品溶液，按倍數(shù)關系稀釋成6種不同質(zhì)量濃度的溶液，分別吸取10μL，記錄色譜峰積分面積。以各黃芩苷對照品質(zhì)量濃度為橫坐標 （X），相應的對照品峰面積積分值為縱坐標 （Y），進行回歸處理，得回歸方程Y=53 342X-5 205，r=0.999，結(jié)果表明，黃芩苷在3.36～67.2μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.6 專屬性考察 精密量取黃芩苷對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10μL，按照 “2.2.1”項下色譜方法測定。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上有相同保留時間的色譜峰，而陰性樣品色譜在此保留時間無干擾，證明本法可行。

2.3 小檗堿測定

2.3.1 色譜條件 按照 《中國藥典》2010年版一部黃柏項下，色譜柱HederaODS-2柱，流動相為磷酸-乙腈（50∶50）（每100mL加十二烷基磺酸鈉0.1 g），柱溫35℃，體積流量1 mL/min，檢測波長265 nm。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱定小檗堿對照品1.33 mg至10 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.133 mg/mL的小檗堿對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取提取物0.1 g，置于10mL的量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45 μm濾膜，即得。

2.3.4 陰性供試品溶液的制備 制備缺黃柏的清肺消痤凝膠提取物，精密稱取0.1 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，過0.45μm濾膜，即得。

2.3.5 標準曲線的繪制 精密吸取一定量上述小檗堿對照品溶液，按倍數(shù)關系稀釋成6種不同質(zhì)量濃度的溶液，分別吸取10μL，記錄色譜峰積分面積。以各小檗堿對照品質(zhì)量濃度為橫坐標 （X），相應的對照品峰面積積分值為縱坐標 （Y），進行回歸處理，得回歸方程Y=53 710X-2 161，r=0.999，結(jié)果表明，小檗堿在5.32～66.2μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.6 專屬性考察 精密量取小檗堿對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10μL，按照 “2.3.1”項下色譜方法測定。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上有相同保留時間的色譜峰，而陰性樣品色譜在此保留時間無干擾，證明本法可行。

3 方法與結(jié)果

3.1 平衡溶解度實驗

3.1.1 沉淀法［6］取清肺消痤凝膠提取物0.2 g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入不同溶劑10 mL，始終保持量瓶中有固體藥物存在，塞上塞子，放入恒溫水浴振蕩器中，溫度保持在37℃，振搖24 h，使其達到充分溶解。將錐形瓶中的藥液連同殘留的固體藥物一同轉(zhuǎn)移至已經(jīng)恒定質(zhì)量的離心管中，離心管在3 500 r/min下離心10 min，傾出上清液，底部殘渣和離心管在60℃烘干至恒定質(zhì)量，稱定質(zhì)量，計算提取物在不同溶劑中的溶解度，結(jié)果見表1，不同pH的磷酸緩沖液中的平衡溶解度見圖1。實驗中選擇的溶劑有水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正辛醇、三氯甲烷以及緩沖體系，pH分別為3.23、4.05、5.12、6.79、7.39、8.07、8.94、10.27，所用緩沖溶液均以0.1 mol/L的磷酸加飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至所需pH。

溶解度=（m加入量-m未溶解量）/V溶劑體積

表1 提取物在37℃條件下不同溶劑中的溶解性能考察

圖1 提取物在37℃條件下不同pH的磷酸緩沖液中的溶解性能考察

3.1.2 指標成分法［6］分別精密吸取上述離心過后的各溶液和磷酸緩沖液上清液4mL至10mL量瓶中，加甲醇充分混勻，稀釋至刻度線。經(jīng)0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液10μL用高效液相色譜法測定溶液中大黃酚、黃芩苷和小檗堿，并計算各指標藥效成分在不同溶劑中的平衡溶解度。結(jié)果顯示，37℃下大黃酚在水中的平衡溶解度為1.09 μg/mL，黃芩苷在水中的平衡溶解度為158.56μg/mL，小檗堿的平衡溶解度為44.48μg/mL，而在有機溶劑中的平衡溶解度結(jié)果見表2，在磷酸緩沖體系中的平衡溶解度見圖2。由結(jié)果可知，37℃時大黃酚、黃芩苷和小檗堿在甲醇中的溶解度最大，在丙酮和乙醇中的溶解度相對較大，在乙酸乙酯中的溶解度最小。在PBS緩沖體系中大黃酚、黃芩苷和小檗堿的溶解度受pH的影響較大，都隨著pH的增加而變大，大黃酚和小檗堿的溶解度均在pH在6.8～7.4范圍內(nèi)變化較顯著。

表2 大黃酚、黃芩苷和小檗堿在37℃不同溶劑中的平衡溶解度

圖2 3種成分在37℃條件下不同pH的磷酸緩沖液中的平衡溶解度

3.2 表觀油水分配系數(shù)的測定［7］稱取清肺消痤凝膠提取物適量至10 mL量瓶中，加入被正辛醇飽和的水和不同pH的PBS緩沖液 （pH分別為3.23、4.05、5.12、6.79、7.39、8.07、8.94、10.27，所用緩沖溶液均以0.1 mol/L的磷酸加飽和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至所需pH）超聲30 min，使其充分溶解，用相同溶劑定容至刻度，保證一直有固體藥物存在，使其呈飽和狀態(tài)，靜止后離心 （3 500 r/min，10 min），上清液4 mL，用甲醇稀釋至10 mL，取上清液過0.45μm濾膜，取10μL經(jīng)HPLC測定其中指標成分的濃度為C0，再取上清液5 mL至具塞錐形瓶中，分別加入5 mL被水飽和過的正辛醇溶液，塞上塞子，放入恒溫水浴振蕩器中，溫度保持在37℃，振搖24 h，靜止后取上層油相4 mL，用甲醇稀釋至10 mL，混勻，過0.45μm濾膜，取10 μL經(jīng)HPLC測定其中指標成分的濃度為C1。按照公式計算表觀油水分配系數(shù) （P），計算公式如下

P=C1/（C0-C1）

結(jié)果，37℃下大黃酚、黃芩苷和小檗堿的正辛醇/水分配系數(shù)分別為5.557（lgP=0.745）、0.204（lg P= -0.689）和0.294（lg P=-0.531）。大黃酚在pH達到5.12時lg P值達到最大為1.57，隨后隨著pH的增加lg P值減小，當pH大于7.39以后，大黃酚的lg P值保持穩(wěn)定。黃芩苷和小檗堿在PBS緩沖液的表觀油水分配系數(shù)隨著pH的增加整體呈降低趨勢。結(jié)果見圖3。

圖3 3種成分在37℃下不同pH的緩沖液中的油水分配系數(shù)

4 討論

中藥提取物是多組分的混合物，其中的各個化合物的性質(zhì)不盡相同，因此中藥提取物的溶解是一個復雜的過程，其中存在化合物之間的競爭性抑制和助溶的雙重作用［8］。提取物溶液是否達到飽和并不能代表指標成分是否也達到飽和溶解度，為了方便比較，并能客觀地反映提取物在不同溶劑中的溶解性，本實驗過程中在不同溶劑中加入等量的提取物，并同時保證在不同溶劑系統(tǒng)中均有大量不溶物存在的情況下，在相同條件下比較提取物和指標成分在不同溶劑中的溶解性能。

體外油水分配系數(shù)是影響藥物胃腸吸收和經(jīng)皮吸收的重要因素，它反映了藥物透過生物膜的能力和在組織液中分配的能力，藥物必須具有一定的油溶性和一定的水溶性，其穿透能力才比較理想。文獻［9］報道，藥物吸收的最佳范圍是-1＜lg P＜2，過低的lg P值（lg P＜-2）化合物不能穿過脂質(zhì)膜；相反，過高的lg P值 （lg P＞3）化合物因為脂溶性強而很難進入附近的血管或淋巴管，轉(zhuǎn)運至全身。

清肺消痤凝膠劑中君藥大黃和臣藥黃柏、黃芩中的藥效指標成分分別為大黃酚、黃芩苷和小檗堿，具有清熱解毒廣譜抗菌，抗病毒的作用。因此本實驗選擇大黃酚、黃芩苷和小檗堿作為評價清肺消痤凝膠提取物溶解度和油水分配系數(shù)的指標具有一定程度的代表性。

采用沉淀法評價提取物在不同溶劑和緩沖液中的整體溶解度，結(jié)果顯示，提取物在不同試劑中的溶解度順序為丙酮＞乙醇＞水＞甲醇＞乙酸乙酯＞三氯甲烷＞正辛醇＞乙腈，提取物在丙酮和乙醇中的溶解度較大，說明提取物在中等極性的溶劑中溶解性較好，在設計經(jīng)皮給藥制劑時可以考慮適量加入丙酮和乙醇作為載體溶劑，以提高藥物的溶解度。在不同pH的緩沖液中的溶解度試驗顯示提取物在不同緩沖體系中的溶解度均大于其在水中的溶解度，且在pH范圍在3.23～6.79的酸性環(huán)境下，藥物溶解度隨著pH的增加而減小，在pH范圍在6.79～10.27的堿性環(huán)境下，藥物溶解度隨著pH的增加而迅速增加，因此建議在進行消痤凝膠劑的研究過程中應該考慮pH對藥物溶解度的影響。

提取物中大黃酚在不同pH的緩沖液中的溶解度隨著pH的增加而增加，這是由于隨著pH的增加大黃酚分子中的羥基不斷地解離，使大黃酚不斷地溶出，但由于大黃酚是多羥基的蒽醌類化合物，脂溶性很強，因此其在由正辛醇和PBS緩沖液組成的油水分配系統(tǒng)中測定的lg P值較高，范圍為0.43＜lg P＜1.56，而且當pH大于7.39以后，大黃酚的lg P值保持穩(wěn)定。提取物中黃芩苷在不同pH的緩沖液中的溶解度隨著pH的增加而增加，但是lg P值隨著pH的增加而減小，這可能是由于黃芩苷是弱酸性黃酮類化合物，在堿性環(huán)境下的溶解度要大于酸性環(huán)境，隨著pH的不斷增加，黃芩苷中的酚羥基不斷解離，使黃芩苷由分子狀態(tài)變?yōu)殡x子態(tài)，水溶性增加，因此其表觀油水分配系數(shù)會不斷減小。提取物中小檗堿在不同pH的緩沖液中的溶解度隨著pH的增加而增加，但是lg P值隨著pH的增加整體呈降低趨勢；在不同pH溶液中，小檗堿以不同的形式存在。在酸性溶液中，小檗堿失去電子以鹽的形式存在，由于其特殊物理性質(zhì)，雖然此時化學結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，但其溶解度降低。隨著溶液pH不斷增加，小檗堿逐漸以鹽的形式向氮雜縮醛的形式轉(zhuǎn)變，穩(wěn)定性逐漸降低，但其在水中的溶解度卻大大提高，加之有大黃酚和黃芩苷等酸性化合物的存在，小檗堿在正辛醇中的溶解度不斷地減小。

由上述平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)的測定可知，清肺消痤凝膠提取物以及其指標成分的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)均受pH的影響很大，故在優(yōu)選制劑工藝時應注意選擇合適的pH，以提高有效成分的經(jīng)皮吸收速率。

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：1001-1528（2015）07-1613-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.052

2014-07-

江蘇省科技廳社會發(fā)展項目 （BE2009682）

任衛(wèi)高（1989—），男，碩士生，從事中藥新劑型開發(fā)研究。Tel：18252067572，E-mail：gaogao8967@163.com

*通信作者：潘金火 （1963—），男，博士，教授，碩士生導師，從事中藥制劑和新藥研發(fā)。Tel：13951856876，E-mail：panjinhuo@ 163.com