王新雨， 鄭曉媚， 譚曉梅

（南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院廣東省中藥制劑重點實驗室，廣東廣州510515）

HPLC-ELSD法同時測定九香蟲中的亞油酸、油酸及軟脂酸

王新雨， 鄭曉媚， 譚曉梅*

（南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院廣東省中藥制劑重點實驗室，廣東廣州510515）

目的建立一種同時定量測定九香蟲中未甲酯化的亞油酸、油酸及軟脂酸方法。方法九香蟲石油醚提取物以

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）分析，采用Prevail C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），乙腈-甲

醇 （95∶5）為流動相進行洗脫，洗脫時間為15 min。結果亞油酸、油酸及軟脂酸峰面積的自然對數與相應質量濃

度的自然對數呈良好的線性關系。其中，亞油酸的線性方程為Y=1.211 7X-2.965 6，r=0.999 0，線性范圍為

0.135 ～0.450 mg/mL，平均加樣回收率為98.1%，RSD為2.5%；油酸的線性方程為Y=1.149 2X-2.757 0，r= 0.999 0，線性范圍為0.268～0.893 mg/mL，平均加樣回收率為99.6%，RSD為2.3%；軟脂酸的線性方程為Y= 1.104 7X-2.327 6，r=0.999 1，線性范圍為0.150～0.500mg/mL，平均加樣回收率為100.1%，RSD為2.8%。結論該方法中的樣品不需要甲酯化，而且測定快速、簡便、準確，可作為九香蟲飲片的質量控制方法。

HPLC-ELSD；九香蟲；亞油酸；油酸；軟脂酸

九香蟲為蝽科昆蟲九香蟲（stink-bug，Aspon- gopus chinensis Dallas）的干燥體，具有理氣止痛，溫中助陽的功效，可用于治療胃寒脹痛、肝胃氣痛、腎虛陽痿、腰膝酸痛［1］。一般認為，九香蟲以含油性成分量大者為佳，而粗脂肪占其干質量的53.0%［2］，其中含有油酸、亞油酸及軟脂酸等脂肪酸。研究表明［3］，脂肪酸對人體具有平衡調節(jié)作用，在降血脂、抗腫瘤、免疫調節(jié)等方面起著重要的作用。

目前，對于亞油酸、油酸及軟脂酸的測定多采用GC法［4］、GC-MS法［5-6］、柱前皂化或衍生化HPLC法［7-9］、HPLC-ELSD法［10-12］。但GC與GCMS法由于柱溫過高，在分析中容易引起亞油酸雙鍵斷裂或異構化［13］，并且GC-MS法在質量控制中難以推廣；柱前衍生化HPLC法通常是先用石油醚將脂肪酸提出，然后取一定量油脂皂化或衍生化進行測定，操作步驟繁瑣，容易造成誤差［14-15］；高效液相-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD）法測定脂肪酸時，樣品不需要甲酯化，操作簡單方便。因此，本實驗建立HPLC-ELSD法來測定九香蟲中的亞油酸、油酸及軟脂酸，為其質量控制和品種評價提供方法。

1 儀器與材料

Agilent1100高效液相色譜儀（美國Agilent Technologies公司）；Alltech 2000蒸發(fā)光散射檢測器 （美國Alltech公司）。石油醚 （60～90℃）、乙醚、冰醋酸均為分析純 （國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈均為色譜純 （德國Merck公司）。亞油酸、油酸、軟脂酸 （批號分別為111622-201203、 111621-201004、 190029-201202，中國食品藥品檢定研究院）。

九香蟲飲片 （安徽廣印堂中藥股份有限公司，批號分別為130801、130901，產地貴州；廣州市藥材公司中藥飲片廠，批號YPA3G0001，產地貴州；廣州至信中藥飲片有限公司，批號130901，產地貴州；康美藥業(yè)股份有限公司，批號130813321，產地四川），經南方醫(yī)科大學中藥鑒定教研室劉傳明副教授鑒定為蝽科昆蟲九香蟲Aspongopus chinensis Dallas的干燥體。

2 方法

2.1 色譜條件 Prevail C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-甲醇 （95∶5），等度洗脫；體積流量0.8 mL/min；漂移管溫度50℃；載氣為N2；體積流量1.2 L/min；柱溫35℃；進樣10μL。色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

圖1 樣品溶液(A)、對照品溶液 (B)和空白溶液(C)的HPLC-ELSD色譜圖Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of blank solution(A) reference substances(B)and stink-bug sam p le (C)

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取亞油酸45 mg、油酸89 mg、軟脂酸90 mg，分別置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度。然后，取上述溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得含亞油酸0.45 mg/m L、油酸0.89 mg/mL、軟脂酸0.50 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粗粉0.25 g，置于具塞試管中，加入石油醚5 mL，超聲20 min，取上清液，重復3次后合并，減壓濃縮至無明顯醚味，加少許甲醇溶解，轉移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 理論塔板數 精密吸取供試品溶液適量，進樣10μL，以供試品主成分峰的保留時間 （tR）和半高峰寬 （W/h/2）計算色譜柱的理論塔板數（n），計算公式為n=5.54［tR/（W/h/2）］2。結果，測得亞油酸、油酸、軟脂酸理論塔板數分別為9 536、12 527、8 872，分離度均大于1.5。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液適量，進樣10μL，連續(xù)6次，計算亞油酸、油酸及軟脂酸峰面積。結果，測得三者 RSD分別為1.7%、1.3%、1.6%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣10μL，計算亞油酸、油酸及軟脂酸峰面積。結果，測得三者RSD分別為1.5%、1.3%、1.8%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取對照品溶液3、4、5、8、9 mL，分別置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制備每1 mL含亞油酸分別為0.14、0.18、0.23、0.36、0.40 mg，含油酸分別為0.27、0.36、0.45、0.70、0.80 mg，含軟脂酸分別為0.15、0.20、0.25、0.40、0.45 mg的溶液，均進樣10μL。然后，分別以亞油酸、油酸及軟脂酸質量濃度的自然對數為橫坐標，峰面積的自然對數為縱坐標，進行線性回歸，結果見表1。由表可知，三者在濃度范圍內，峰面積自然對數與其質量濃度自然對數均呈良好線性關系。

表1 亞油酸、油酸和軟脂酸的線性方程Tab.1 Linear equation of linoleic acid,oleinic acid and palm itic acid

2.3.5 重復性試驗 按照 “2.2.2”項下方法，平行制備6份供試品溶液，進樣10μL，再采用外標兩點法計算亞油酸、油酸及軟脂酸的含有量。結果，測得三者RSD分別為1.8%、1.7%和1.7%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 采用加樣回收法，平行制備6份。精密稱取九香蟲0.125 g，置于試管中，分別加入亞油酸1.45 mg、油酸3.15 mg、軟脂酸1.60 mg，再加入石油醚5 mL，超聲20 min，取上清液，重復3次后合并，減壓濃縮至無明顯醚味，少許甲醇溶解，轉移至25mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。然后，進樣10μL，外標兩點法計算三者的含有量和加樣回收率，計算公式為加樣回收率%=［測得量（mg）-樣品中含量（mg）］/對照品加入量×100%，結果見表2、表3和表4。由表可知，三者的平均加樣回收率分別為98.1%、99.6%及100.1%，RSD分別為2.5%、2.3%及2.8%，表明該方法回收率良好。

表2 亞油酸加樣回收實驗結果(n=6)Tab.2 Results of recovery tests for linoleic acid(n=6)

表3 油酸加樣回收實驗結果(n=6)Tab.3 Results of recovery tests for oleinic acid(n=6)

表4 軟脂酸加樣回收實驗結果(n=6)Tab.4 Results of recovery tests for palm itic(n=6)

2.4 樣品測定 取九香蟲粗粉5批，分別精密稱取0.25 g，按照 “2.2.2”項下方法操作，外標兩點法計算樣品中亞油酸、油酸及軟脂酸的含有量，結果見表5。

表5 樣品測定結果(n=3)Tab.5 Determ ination resu lts of sam p les(n=3)

3 結果與討論

由表5可知，5批樣品中亞油酸、油酸、軟脂酸的含有量差別較大。在本實驗所用的飲片中，批號130813321者為清水炮制，而且其中這3種成分的含有量均高于其他4批鹽水炮制的飲片。因此，不同炮制方法是否會影響其有效成分的含有量尚有待于后期進一步研究。

實驗發(fā)現(xiàn)，流動相乙腈會影響分離效果，當乙腈-甲醇的比例為95∶5時，亞油酸與油酸的分離度大于1.5，且峰形較好。另外，當流動相的體積流量過高時，基線不平穩(wěn)，而在0.8 m L/min時，基線平穩(wěn)。而且，漂移管溫度和氮氣體積流量偏低也能影響基線穩(wěn)定性，當溫度為50℃，體積流量為1.2 L/min時，基線平穩(wěn)。樣品前處理采用正交試驗，從提取時間、提取次數以及石油醚加入量的角度進行考查，發(fā)現(xiàn)當加入石油醚2 m L、超聲20min、提取3次時，亞油酸、油酸及軟脂酸的提取效果最好。

本實驗采用HPLC-ELSD法測定九香蟲中的亞油酸、油酸及軟脂酸含有量，不需要甲酯化即可直接分析，避免了甲酯化產物的多樣性、甲酯化不徹底等問題，而且操作簡便，結果準確可靠。因此，該方法可作為九香蟲藥材的質量控制方法，也可為其他藥材中的這3種成分含有量分析提供參考。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：10.

［2］涂愛國，劉宇文，殷紅妹.氣相色譜-質譜聯(lián)用分析九香蟲脂肪油的化學成分［J］.江西中醫(yī)藥，2012，43（11）：66-67.

［3］陳銀基，鞠興榮，周光宏.飽和脂肪酸分類與生理功能［J］.中國油脂，2008，33（3）：35-39.

［4］肖會敏，何 悅，楊 倩，等.GC法測定椒目仁油中油酸、亞油酸及α-亞麻酸［J］.中成藥，2011，33（8）：1361-1364.

［5］王 加，王 淼，翁 琰，等.GC-MS法分析川烏炮制前后揮發(fā)性成分［J］.沈陽藥科大學學報，2014，31（8）：622-628.

［6］蘭 梅，王 平，王志英，等.巴豆油化學成分的GC-MS分析［J］.中藥材，2012，35（7）：1105-1108.

［7］羅淑文，鄧遠輝，朱艷紅.柱前衍生化HPLC法測定鴉膽子油中油酸和亞油酸的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22（3）：328-330.

［8］劉 威，張 帥，付小環(huán)，等.柱前皂化HPLC法測定不同產地桃仁中亞油酸和油酸的量［J］.中草藥，2013，43（14）：2000-2003.

［9］王 遠，郭 萍，李 暉，等.RP-HPLC法同時測定紫蘇子中α-亞麻酸和亞油酸的含量［J］.藥物分析雜志，2012，32（2）：252-254.

［10］張 銳，王 玉，石蓓佳，等.HPLC-ELSD測定聚山梨酯80中聚醚組成及油酸含量［J］.藥物分析雜志，2013，33（6）：994-998.

［11］謝元勛，何厚洪，盛衛(wèi)國，等.HPLC-ELSD測定油菜蜂花粉中6種脂肪酸［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，2014，31（5）：559-563.

［12］劉慧靈，馬國需，孫忠浩，等.反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定不同產地蕤仁藥材中亞油酸的含量［J］.中國藥學雜志，2014，49（15）：1355-1357.

［13］裴 瑾，顏永剛，萬德光.桃仁中脂肪酸的含量分析研究［J］.中藥材，2009，32（6）：908-910.

［14］侯冬巖，回瑞華，李鐵純，等.萊菔子中脂肪酸及主成分γ-亞麻酸的分析［J］.質譜學報，2011，32（2）：108-111.

［15］秦建平，陸艷芹，羅雪磊，等.HPLC同時測定火麻仁中α-亞麻酸、亞油酸和油酸含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（7）：71-73.

Simultaneous determ ination of linoleic acid，oleinic acid and palm itic acid in stink-bug by HPLC-ELSD

WANG Xin-yu， ZHENG Xiao-mei， TAN Xiao-mei*
（School of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University；Guangdong Provincal Key Laboratory of Chinese Materia Medica Preparation，Guangzhou 510515，China）

AIMTo establish a method for simultaneous determination of linoleic acid，oleinic acid and palmitic acid content without methyl esterification in stink-bug（Aspongopus chinensis Dallas）.M ETHODSThe high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection（HPLC-ELSD）method of stink-bug petroleum ether extractwas applied to Prevail C18Column（250 mm×4.6mm，5μm）with acetonitrile andmethanol asmobile phase，and the elution time was15 min.RESULTSThe linear response was calculated by natural logarithm，the linear range of linoleic acid was 0.135～0.450 mg/mL with the regression equation of Y= 1.211 7X-2.965 6，r=0.999 0；the linear range of oleinic acid was 0.268～0.893 mg/mL with the regression equation Y=1.149 2X-2.757 0，r=0.999 0；the linear range of palmitic acid was 0.150～0.500 mg/mL with the regression equation Y=1.104 7X-2.327 6，r=0.999 1.Their average recoverieswere 98.1%，99.6%and 100.1%，and their RSDs were 2.5%，2.3%and 2.8%，respectively.CONCLUSIONThe sample does not need methyl esterification by thismethod，having the advantages of easy operation，accuracy and fast，so it can be used as a quality controlmethod for stink-bug.

HPLC-ELSD；stink-bug（Aspongopus chinensis Dallas）；linoleic acid；oleinic acid；palmitic acid

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1522-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.027

2014-10-30

王新雨 （1986—），女，博士，研究方向為中藥制劑。Tel：13246857938，E-mail：379319742@qq.com

*通信作者：譚曉梅 （1963—），女，博士，研究員，博士生導師，研究方向為中藥新制劑。Tel：（020）61648265，E-mail：13710730705@163.com