彭 昕， 吉慶勇， 李玉蘭*， 張煜炯

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波315100；2.麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江麗水323000）

瀕危藥用植物三葉青ISSR分子標(biāo)記的建立

彭 昕1， 吉慶勇2， 李玉蘭1*， 張煜炯1

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波315100；2.麗水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江麗水323000）

目的對(duì)三葉青的簡(jiǎn)單重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （ISSR-PCR）體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化，并將其應(yīng)用于野生三葉青種質(zhì)資源的遺傳分子標(biāo)記。方法采用單因素試驗(yàn)，對(duì)三葉青ISSR-PCR反應(yīng)條件中的Mg2+、dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶濃度和退火溫度等因素進(jìn)行篩選，之后結(jié)合正交試驗(yàn)來(lái)選擇多態(tài)性高、重復(fù)性好的ISSR引物。結(jié)果建立了ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系，為25μL反應(yīng)體系中含有2.5 mmol/L Mg2+、0.2μmol/L引物、0.25 mmol/L dNTP、50 ng DNA模板、0.5U TaqDNA聚合酶，并利用U810等16條引物，初步構(gòu)建了15份三葉青種質(zhì)資源的ISSR指紋圖譜，平均多態(tài)條帶百分率達(dá)57.0%。結(jié)論該反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和多態(tài)性良好，可滿足對(duì)三葉青野生資源的遺傳變異水平和結(jié)構(gòu)分析的研究考察。

三葉青；ISSR；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)；遺傳多樣性

三葉青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg是我國(guó)特有的葡萄科崖爬藤屬珍稀藥用植物，主要分布于浙江、廣西、江西等少數(shù)省份［1］，以地下塊根或全草入藥。它可用于治療高熱、肝炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及病毒性腦膜炎等多種疾病，而且其主要活性成分黃酮對(duì)肝癌、腸癌、胃癌和血癌細(xì)胞株具有促凋亡作用［2-3］。目前，三葉青的野生資源瀕臨滅絕，亟待保護(hù)，其組培快繁和栽培技術(shù)雖已有一些探索［4-7］，但技術(shù)尚未完全成熟，遠(yuǎn)不能滿足臨床需求。研究物種居群間的遺傳變異水平可為基因資源保護(hù)策略的制定、品種鑒別、良種選育等提供科學(xué)依據(jù)，而目前關(guān)于三葉青種質(zhì)資源保護(hù)方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

如今，在遺傳多樣性評(píng)價(jià)中使用最廣泛的DNA標(biāo)記技術(shù)有RFLP、RAPD、SSR、ISSR、AFLP、SRAP和SNP。其中，簡(jiǎn)單重復(fù)序列ISSR（inter-simple sequence repeats）標(biāo)記是利用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在SSR序列的3′端或5′端加上2～4個(gè)隨機(jī)核苷酸，對(duì)錨定引物互補(bǔ)的間隔不大的SSR基因片段進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR）擴(kuò)增［7］。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、多態(tài)性好、重復(fù)性高、無(wú)需預(yù)先知道任何靶序列的DNA背景信息、模板需要量少等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析等方面的研究［8-10］，但作為一種基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，其反應(yīng)條件受到模板DNA及Taq DNA聚合酶用量、Mg2+、dNTP、引物濃度、退火溫度等因素的影響，故為了實(shí)現(xiàn)分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，進(jìn)行ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化是非常必要的。本實(shí)驗(yàn)利用單因子和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，對(duì)以上各因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，并篩選出一批多態(tài)性好、重復(fù)性高的引物，建立了一套穩(wěn)定的三葉青ISSR-PCR反應(yīng)體系，并對(duì)其穩(wěn)定性和重復(fù)性進(jìn)行了檢測(cè)，為關(guān)于三葉青的遺傳多樣性分析和物種保護(hù)研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料 所用試劑及DNA Marker S plus（包括100、250、500、750、1 000、1 500、2 000、3 000、5 000 bp 9個(gè)條帶）均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；100條UBC 801-UBC900 ISSR引物（加拿大哥倫比亞大學(xué)公布其序列及編號(hào)），上海生工生物工程有限公司合成。

本實(shí)驗(yàn)所用的三葉青藥材均為野生品種，經(jīng)麗水市農(nóng)科院吉慶勇高級(jí)農(nóng)藝師和浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校楊雄志教授鑒定為三葉青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg。然后，利用表1中編號(hào)為jx1的材料對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并選取外觀性狀及居群生境差異較大的zj2、gx1和jx1材料用于有效引物的篩選，所有材料均用于優(yōu)化后反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢測(cè)。

1.2 儀器 Eppendorf Master cycler PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）；Gel Doc XR+紫外凝膠成像分析儀、Sub-Cell系統(tǒng)水平電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機(jī) （浙江納德科學(xué)儀器有限公司）。

表1 材料來(lái)源Tab.1 Sources ofmaterials

2 方法

2.1 植物材料采樣及DNA提取 每種藥材取樣5株，每株取4～6 g新鮮葉片放入密封塑料袋，硅膠干燥，冷藏于-80℃超低溫冰箱中，供提取DNA用?？侱NA提取采用改良CTAB法［11］，0.8%瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測(cè)儀檢查總DNA的完整性及純度，并將其濃度稀釋至50 ng/μL備用。

2.2 PCR擴(kuò)增及引物篩選 ISSR原初擴(kuò)增反應(yīng)的體系為25μL PCR反應(yīng)體積中含10×Taq酶配套緩沖液2.5μL、MgCl22.5 mmol/L、Taq酶2U、模板DNA 50 ng、引物0.3μmol/L、dNTP 0.1 mmol/L。原初擴(kuò)增程序?yàn)?5℃下預(yù)變性5 min（95℃45 s、50℃60 s、72℃60 s），進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，72℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)含有5 mg/L溴化乙錠（EB）的2%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外凝膠成像分析儀內(nèi)觀察并拍照。

2.2.1 單因素試驗(yàn) 先根據(jù)原初的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行引物初篩，選擇能看到清晰條帶的引物U810（序列為GAG AGA GAG AGA GAG AT），對(duì)其退火溫度 （采用梯度PCR儀自動(dòng)生成的8個(gè)梯度）、Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度、模板DNA量、TaqDNA聚合酶用量這6個(gè)因素逐一設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，見(jiàn)表2。在對(duì)某單一因素進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，其他因素均保持不變，以探討各因素對(duì)反應(yīng)體系的影響，并篩選出最佳條件，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

表2 單因素試驗(yàn)中所采用的各因素和水平 (25μL反應(yīng)體系)Tab.2 Single factor test design for the factors and levels of ISSR-PCR reaction

2.2.2 正交試驗(yàn) 優(yōu)化PCR反應(yīng)體系時(shí)采用L9（34）設(shè)計(jì)，根據(jù) “2.2.1”項(xiàng)下方法初步篩選合理的范圍，對(duì)Mg2+、引物、dNTP和模板DNA進(jìn)行4因素3水平篩選，見(jiàn)表3。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)9個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，利用Quantity one分析軟件，并按照特異性條帶強(qiáng)弱，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)記處理。其中，條帶數(shù)量豐富、清晰度高、特異條帶最強(qiáng)的記為1分，最差的記為9分，其他情況與其相比，取整數(shù)值，從低到高依次打分［12-13］。

表3 ISSR-PCR反應(yīng)L9(34)正交設(shè)計(jì)Tab.3 L9(34)orthogonal design for the factors and levels of ISSR-PCR reaction

2.2.3 引物篩選 采用 “2.2.2”項(xiàng)下優(yōu)化的擴(kuò)增條件 （除退火溫度項(xiàng)需對(duì)每個(gè)引物逐一篩選外），對(duì)100條 ISSR引物進(jìn)行篩選。以擴(kuò)增出的條帶數(shù)量多、多態(tài)性好、清晰度高、重復(fù)性好為原則，確定有效引物。

2.3 體系穩(wěn)定性驗(yàn)證及ISSR圖譜建立 將“2.2.3”項(xiàng)方法篩選出的引物采用 “2.2.2”項(xiàng)下優(yōu)化的擴(kuò)增條件，對(duì)15份三葉青材料反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，每個(gè)材料重復(fù)3次，建立ISSRPCR擴(kuò)增圖譜。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)先根據(jù)原初的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行引物初篩，選擇能看到清晰條帶的引物U810來(lái)確定退火溫度，其對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響見(jiàn)圖1。由圖可知，雖然各溫度均能擴(kuò)增出條帶，但其數(shù)量及清晰度有明顯區(qū)別。45℃時(shí)雖然能擴(kuò)增出較多條帶，但均非常彌散；53.8～56℃時(shí)雖然一些條帶亮度增加，但中分子質(zhì)量區(qū)的條帶數(shù)明顯減少，之間出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，而且大分子質(zhì)量區(qū)出現(xiàn)了一些非特異性弱帶，背景較高；49.4～51.8℃時(shí)擴(kuò)增出的條帶數(shù)量最多，而且其清晰度和亮度較高?？紤]到較高退火溫度有利于減少雜帶的產(chǎn)生，因此本實(shí)驗(yàn)選擇52℃為引物U810用于三葉青ISSR擴(kuò)增的最佳退火溫度。

圖1 退火溫度對(duì)三葉青ISSR擴(kuò)增的影響Fig.1 Effect of annealing tem perature on T.hem sleyanum ISSR amplification

確定退火溫度后，逐一改變Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度、模板DNA量、TaqDNA聚合酶用量這5種因素的水平，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，當(dāng)Mg2+濃度小于2 mmol/L時(shí)，不能擴(kuò)增出條帶；濃度為3 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增出的條帶多，而且背景清晰。當(dāng)dNTP濃度上升時(shí)，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量增加，但達(dá)到0.3 mmol/L時(shí)，高分子質(zhì)量區(qū)的主帶旁邊出現(xiàn)1條雜帶，因此選擇0.2 mmol/L為最佳濃度。當(dāng)引物濃度低于0.2μmol/L時(shí)，雖然擴(kuò)增出的條帶較清晰，但中等及低相對(duì)分子質(zhì)量區(qū)擴(kuò)增出的條帶數(shù)目明顯減少，亮度降低，而且高分子質(zhì)量區(qū)出現(xiàn)較多雜帶；濃度為0.3μmol/L時(shí)，低分子質(zhì)量區(qū)出現(xiàn)疑似引物二聚體的雜帶，因此選擇0.2μmol/L的引物濃度為PCR反應(yīng)體系的最佳濃度。當(dāng)模板DNA用量在50～75 ng時(shí)，條帶數(shù)目最多，清晰度高；用量在50 ng以下時(shí)，條帶清晰度和產(chǎn)量明顯提高；用量在100 ng時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量雖然也明顯提高，但高分子及低分子質(zhì)量區(qū)分別出現(xiàn)1條非特異性雜帶。

圖2 M g2+、引物、dNTP和模板DNA濃度對(duì)三葉青ISSR擴(kuò)增的影響Fig.2 E ffect of M g2+,dNTP,primer and tem p late DNA concentration on T.hemsleyanum ISSR am p lification

從圖3可以清晰地看出，在所選擇的4個(gè)濃度范圍內(nèi)，Taq酶對(duì)條帶數(shù)量及清晰度沒(méi)有明顯影響，故從實(shí)驗(yàn)成本考慮，選擇0.5 U為最佳用量。

3.2 PCR正交設(shè)計(jì)結(jié)果 圖4為正交設(shè)計(jì)ISSR擴(kuò)增結(jié)果，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)其進(jìn)行方差分析，見(jiàn)表4。由表可知，Mg2+濃度、dNTP、引物濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響 （P＜0.05），而模板DNA濃度的影響不明顯 （P＞0.05）。均方差結(jié)果顯示，這4個(gè)因素對(duì)其影響的主次順序依次為Mg2+濃度＞dNTPs＞引物濃度＞DNA模板濃度，與極差分析的結(jié)果相同。然后，進(jìn)一步對(duì)各因素的不同水平進(jìn)行多重比較，發(fā)現(xiàn)Mg2+濃度在3個(gè)水平之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.011（2.5和3.0 mmol/L之間）、0.000（2.5和3.5 mmol/L之間）和0.000（3.5和2.5 mmol/L之間），結(jié)合表5中的PCR結(jié)果均值可知，Mg2+濃度在2.5 mmol/L下最適合；引物濃度在0.2μmol/L時(shí)，與其他兩個(gè)水平之間有顯著差異，P值分別為0.000（0.2和0.25μmol/L之間）和0.001（0.2和0.15μmol/L之間），結(jié)合表5可知，引物濃度在0.2μmol/L下最適合；dNTP濃度在3個(gè)水平間均有顯著性差異，P值均為0.000，結(jié)合表5中可知，dNTP濃度0.25 mmol/L下最適合。同時(shí)，模板DNA濃度在3個(gè)水平間均無(wú)顯著性差異，P值分別為0.728（50和100 ng、75和100 ng之間）、0.489（50和75 ng之間）。綜上所述，Mg2+濃度2.5 mmol/L、引物濃度0.2μmol/L、dNTPs濃度0.25 mmol/L、DNA模板濃度50～100 ng為三葉青ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系。

圖3 Taq DNA聚合酶對(duì)三葉青ISSR擴(kuò)增的影響Fig.3 Effect of Taq DNA polymerase dosage on T.hemsleyanum ISSR am plification

表4 正交試驗(yàn)中各因素方差分析Tab.4 Analysis of variance for factors of orthogonal design

表5 各因素不同處理水平結(jié)果均值差異顯著性Tab.5 Significance among themeans of different factor levels

圖4 L9(34)正交設(shè)計(jì)ISSR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of L9(34)orthogonal design

3.3 體系穩(wěn)定性驗(yàn)證及ISSR圖譜多態(tài)性分析 經(jīng)篩選確定的有效引物見(jiàn)表6，而且從圖5和圖6可知，U810和U811引物能從表1所列的15份種質(zhì)材料中擴(kuò)增出清晰度高、多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的DNA條帶，表明優(yōu)化后的ISSR-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，在此基礎(chǔ)上，以擴(kuò)增出的條帶數(shù)量多、多態(tài)性好、清晰度高、重復(fù)性好為原則，從100個(gè)ISSR引物中篩選出16個(gè)擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性高的引物（表6）。同時(shí)，它們又共擴(kuò)增出135個(gè)條帶，長(zhǎng)度為200～2 000 bp，每條引物平均產(chǎn)生8.4個(gè)條帶，其中多態(tài)性帶77條，平均多態(tài)率達(dá)57.0%。由此可知，ISSR指紋能在居群水平中提供適量的多態(tài)性，可滿足對(duì)三葉青資源遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)分析和種質(zhì)資源鑒定的研究考察。

表6 篩選出的三葉青ISSR標(biāo)記分析的引物序列及其擴(kuò)增結(jié)果Tab.6 Primer sequence screened for ISSR analysis of T.hemsleyanum and their amplification results

圖5 引物U810對(duì)15份三葉青DNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Amplification results of 15 DNA samp les from T.hemsleyanum with primer U810

圖6 引物U 811對(duì)15份三葉青DNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 Am p lification results of 15 DNA sam p les from T.hemsleyanum w ith primer U811

4 討論

ISSR是在基因組中由1～6個(gè)核苷酸組成的，基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的DNA無(wú)意義區(qū)域片段，廣泛分布于基因組的不同位置，容易受氣溫、日照等環(huán)境條件的影響而出現(xiàn)變異，并且進(jìn)化變異速度快，蘊(yùn)含的多態(tài)性位點(diǎn)多，具有很高的多態(tài)性檢測(cè)效率［8］。目前，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性的評(píng)價(jià)［14］、品種鑒別［15］、指紋圖譜庫(kù)建立［16］、物種間親緣關(guān)系及系統(tǒng)進(jìn)化［17］等領(lǐng)域。

PCR擴(kuò)增容易受到Mg2+、引物、dNTP、DNA模板的濃度與純度，以及擴(kuò)增程序等諸多因素影響。Mg2+濃度過(guò)低會(huì)降低Taq酶活性，而過(guò)高則會(huì)引起非特異性擴(kuò)增，而且它還能與體系中的dNTP、引物、模板結(jié)合，影響模板與引物的結(jié)合率，產(chǎn)生非特異性條帶［12］，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)Mg2+是對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響最大的因素，這與東方百合ISSR反應(yīng)體系相似［18］。dNTP是PCR反應(yīng)中的原料，濃度過(guò)低導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)量不足，而濃度過(guò)高則導(dǎo)致PCR錯(cuò)配，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，而且會(huì)對(duì)Mg2+產(chǎn)生拮抗作用，使反應(yīng)中的有效Mg2+濃度下降，從而影響聚合酶活力［19］，本實(shí)驗(yàn)中dNTP濃度上升時(shí)，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物隨之增加，但濃度達(dá)到0.3 mmol/L時(shí)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。一般認(rèn)為，引物濃度過(guò)低時(shí)，擴(kuò)增的條帶較弱，數(shù)量也比較少，但濃度過(guò)高時(shí)會(huì)產(chǎn)生引物二聚體和非特異性擴(kuò)增［18］，但本實(shí)驗(yàn)中引物濃度過(guò)低時(shí)也產(chǎn)生了非特異性擴(kuò)增，推測(cè)可能是因?yàn)檫^(guò)低的引物濃度與模板目標(biāo)片段結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)力不足，擴(kuò)大了引物在基因組上配對(duì)的隨機(jī)性，從而形成了一些分子質(zhì)量較大的非特異性產(chǎn)物。研究［18，20-21］表明，模板DNA的濃度適用范圍較寬，對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)的影響不大，25～200 ng之間均能擴(kuò)增出較清晰的條帶，本實(shí)驗(yàn)中雖然DNA模板濃度在一定范圍內(nèi)對(duì)條帶的產(chǎn)量及多態(tài)性影響不大，但濃度達(dá)到100 ng時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，與夏枯草ISSR-PCR反應(yīng)體系［13］相似，而且在所選擇的用量范圍內(nèi)，Taq酶對(duì)PCR產(chǎn)物量及條帶數(shù)量幾乎沒(méi)有影響，這與一些研究［12，19］相一致，而東方百合ISSR體系［18］中的Taq酶對(duì)結(jié)果影響非常顯著，可能與所使用酶的生產(chǎn)質(zhì)量等因素有關(guān)。一般認(rèn)為，退火溫度過(guò)高時(shí)，引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降，產(chǎn)生的條帶較少；溫度過(guò)低時(shí)，可造成引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物增加［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，退火溫度過(guò)低時(shí)，條帶彌散，目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量低，而退火溫度過(guò)高時(shí)，雖然產(chǎn)生的條帶有一部分缺失，但同時(shí)也出現(xiàn)個(gè)別非特異性條帶。在實(shí)際操作過(guò)程中，一般參考引物理論Tm值來(lái)確定最佳退火溫度，但同一引物對(duì)于不同物種時(shí)，退火溫度可能不同，甚至差異較大，如瓜蔞ISSR分析時(shí)［22］，引物810所采用的退火溫度為53.6℃；王玉山等［23］用引物810對(duì)長(zhǎng)葉紅砂ISSR分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，最佳退火溫度為48℃；本實(shí)驗(yàn)三葉青ISSR體系中，引物810的最佳退火溫度為52℃。因此，退火溫度需要在參考引物理論Tm值的基礎(chǔ)上加以適當(dāng)調(diào)整，以期得到穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

與多因素試驗(yàn)相比，單因素試驗(yàn)可較為直觀地分析各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，易篩選出各因素的最佳水平，但可能會(huì)遺漏各因素之間的互作效應(yīng)，根據(jù)其優(yōu)化組合而形成的試驗(yàn)體系可能在某種程度上偏離真正的最佳條件［19］。而且，單因素試驗(yàn)無(wú)法考察各因素不同水平對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響的差異顯著性，而正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)在同時(shí)檢驗(yàn)多個(gè)因素的同時(shí)，能縮小試驗(yàn)規(guī)模，并可通過(guò)方差分析來(lái)統(tǒng)計(jì)各因素對(duì)結(jié)果影響的差異，但仍存在對(duì)各種因素的水平設(shè)計(jì)是否適當(dāng)以及對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)有較大主觀性等局限。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合單因素和正交兩種試驗(yàn)設(shè)計(jì)，先通過(guò)單因素試驗(yàn)來(lái)選定各因素的適宜水平范圍，然后參照選出的水平范圍進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，從而篩選出最佳反應(yīng)體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ISSR指紋圖譜能夠在居群水平上提供豐富的多態(tài)性，表明經(jīng)過(guò)優(yōu)化后建立的ISSR-PCR反應(yīng)體系具有較好的穩(wěn)定性，可以滿足對(duì)三葉青野生資源的遺傳變異水平和結(jié)構(gòu)分析的研究考察。

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Construction of ISSR molecular marker system for endangered plant Tetrastigma hemsleyanum

PENG Xin1， JIQing-yong2， LIYu-lan1*， ZHANG Yu-jiong1
（1.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China；2.Lishui Academy of Agricultural Science，Lishui323000，China）

AIMTo construct a proper ISSR-PCR reaction system and amplification process for germplasm of wild Tetrastigma hemsleyanum.METHODSSingle factor testwas applied to the optimization of the influencing factors，including annealing temperature，Mg2+concentration，dNTP concentration，template DNA dosage，Taq DNA polymerase dosage，primer concentration.Orthogonal design was applied to the selection of stable and repeatable ISSR primers.RESULTSThe optimal reaction system for ISSR analysis contained 2.5mmol/LMgCl2，0.2 μmol/L ISSR primers，0.25 mmol/L dNTP，50 ng of template DNA，and 0.5 U of Taq DNA polymerase in 25 μL total volume.Based on 16 primers such as U810，the molecularmarker system of 15 samples of T.hemsleyanum was established withmore than 57.0%of average polymorphic bands.CONCLUSIONThe ISSR-PCR reaction system constructed in this study is highly polymorphic and has high reliability and stability，which could be used to detect the genetic diversity and investigate the genetic structure of T.hemsleyanum.

Tetrastigma hemsleyanum；ISSR；single factor test；orthogonal design；genetic diversity

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1507-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.024

2014-08-07

2013年浙江省公益性技術(shù)資助項(xiàng)目 （2013C32103）；2013年浙江省教育廳高?？蒲许?xiàng)目 （Y201330174）

彭 昕（1980—），女，碩士，副教授，研究方向?yàn)樗幱弥参锓肿由飳W(xué)。E-mail：pengx@mail.zjpc.net.cn *通信作者：李玉蘭（1963—），女，教授，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。E-mail：LiyL@mail.zjpc.net.cn