趙 磊， 陳 劍， 印 敏， 任冰如， 李維林

（江蘇省中國科學(xué)院植物研究所江蘇省抗糖尿病藥物篩選服務(wù)中心，江蘇南京210014）

UPLC-Q-TOF-MS法分析枇杷葉的倍半萜苷類化合物

趙 磊， 陳 劍， 印 敏， 任冰如*， 李維林

（江蘇省中國科學(xué)院植物研究所江蘇省抗糖尿病藥物篩選服務(wù)中心，江蘇南京210014）

目的采用超高效液相-四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)對分離得到的枇杷葉總倍半萜苷類成分進行定性分析，并對其裂解途徑進行研究總結(jié)。方法枇杷葉乙醇提取物經(jīng)大孔樹脂、聚酰胺柱色譜和RP-18柱色譜處理后，得到的枇杷葉總倍半萜苷采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6mm×100mm，1.8μm），甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，ESI源負離子模式下采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。結(jié)果從總倍半萜苷中得到5個倍半萜苷類化合物，其二級質(zhì)譜裂解規(guī)律均相同，表現(xiàn)為逐個脫去寡糖鏈上的糖基，產(chǎn)生特征碎片離子m/z 675、529、383，最后生成m/z205的特征苷元碎片。結(jié)論其中2個倍半萜苷類成分可能是僅在苷元C-6和C-7位上構(gòu)型有差異的loquatifolin A和6，7-cis-nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→4）-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-［α-L-rhamnopyranosyl-（1→6）］-β-D-glucopyranoside。

枇杷葉；倍半萜苷；UPLC-Q-TOF-MS；loquatifolin A；6，7-cis-nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→4）-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-［α-L-rhamnopyranosyl-（1→6）］-β-D-glucopyranoside

枇杷葉為薔薇科植物枇杷Friobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的干燥葉，是我國傳統(tǒng)常用中藥，具有清肺止咳，降逆止嘔之功效，用于治療肺熱咳嗽、氣逆喘急、胃熱嘔逆、煩熱口渴等癥狀［1］。枇杷葉的主要成分為三萜酸［2-3］、倍半萜苷［4-6］、黃酮［7-8］、多酚［9］等?，F(xiàn)代研究表明，枇杷葉具有顯著的降血糖作用，所含的萜類成分可能是其主要活性基礎(chǔ)物質(zhì)［3，10］。目前，對枇杷葉三萜酸類化合物已開展了較為系統(tǒng)的研究［2-3，11-12］，但對同樣具有降血糖作用［13-14］的倍半萜苷類化合物研究相對較少。因此，深入考察該類化合物的結(jié)構(gòu)對闡明其活性物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。

如今，從枇杷葉中分離鑒定出的倍半萜苷類化合物一般由苷元和寡糖鏈兩部分組成。其中，苷元主要為橙花叔醇（nerolidol）或異旋花醇（isohumbertiol），而寡糖鏈一般由1～3個鼠李糖與葡萄糖的C′-2和 （或）C′-6位連接組成，但此類結(jié)構(gòu)較為少見，迄今只在枇杷葉中發(fā)現(xiàn)。由于該類型倍半萜苷具有結(jié)構(gòu)相似、連糖多的特點，因此分離和結(jié)構(gòu)鑒定具有一定難度。近幾年，迅速發(fā)展的超高效液相色譜（UPLC）與四級桿飛行時間質(zhì)譜（QTOF-MS）聯(lián)用技術(shù)在天然產(chǎn)物的研究中得以廣泛應(yīng)用，為快速分析天然產(chǎn)物中的有效成分，及加快尋找先導(dǎo)化合物的分析途徑提供一個高效和切實可行的分析方法。本實驗首先通過反復(fù)柱層析色譜分離得到枇杷葉總倍半萜苷，然后利用超高效液相-四級桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)，結(jié)合枇杷葉中已知化合物的相關(guān)信息，對倍半萜苷類成分進行分析，旨在總結(jié)其裂解規(guī)律，并發(fā)現(xiàn)未知倍半萜苷，為進一步研究該類化合物提供參考。

1 儀器與試藥

1260UPLC-6530Q-TOF-MS，配有電噴霧離子源（ESI）及MassHunter 5.0工作站（美國Agilent Technologies公司）。

枇杷葉采自江蘇省蘇州市，由江蘇省中國科學(xué)院植物研究所郭榮麟研究員鑒定為枇杷Friobotrya japonica（Thunb.）Lindl.的干燥葉，標本保存于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所標本館 （編號328636）。枇杷葉倍半萜苷對照品nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→4）-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-［α-L-rhamnopyranosyl-（1→6）］-β-D-glucopyranoside（Ⅰ）和nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→4）-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-β-D-glucopyranoside（Ⅱ）（自制，純度95%以上，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1）；甲醇為色譜純農(nóng)殘級（美國Tedia公司）；甲酸為色譜純 （美國ROE公司）；水為屈臣氏蒸餾水 （屈臣氏集團有限公司）；其他試劑均為分析純 （國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備 取干燥枇杷葉10 kg，粉碎，80%乙醇回流提取2次，合并提取液濃縮離心，取上清液，經(jīng) XAD16大孔樹脂柱，水、40%、60%、90%乙醇梯度洗脫。之后，洗脫液經(jīng)HPLC檢測，與對照品Ⅰ、Ⅱ的紫外吸收和保留時間進行比對，發(fā)現(xiàn)倍半萜苷類化合物主要存在于60%乙醇洗脫部位。將該部位濃縮后進一步經(jīng)聚酰胺柱色譜，水-乙醇梯度洗脫，HPLC和TLC跟蹤檢測后可知，經(jīng)聚酰胺處理后的倍半萜苷主要集中于水洗部位。將該部位繼續(xù)經(jīng)RP-18柱色譜，水-甲醇 （50%、100%甲醇）梯度洗脫，得到純化后的總倍半萜苷2.2 g（100%甲醇部位）。所得成分及對照品Ⅰ、Ⅱ用甲醇溶解，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進樣分析。

2.2 分析條件

2.2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，1.8μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液 （B），梯度洗脫 （0～25 min，60%～68%A；25～35 min，68%～77%A）；柱溫35℃；體積流量0.5 mL/min；進樣量10μL；檢測波長210 nm。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源 （ESI），負離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500；毛細管電壓3 500 V；碎裂電壓180 V；干燥氣 （N2）體積流量10 L/min；干燥氣溫度350℃；霧化氣壓力50 psi（1 psi=6.895 kPa）；碰撞誘導(dǎo)解離（CID）能量40 eV；碰撞氣為N2。實驗數(shù)據(jù)采用Masshunter Qualitative Analysis（B.05.00）分析軟件處理。

2.3 色譜分析 實驗表明，枇杷葉醇提物經(jīng)多種柱層析色譜處理后，有利于倍半萜苷的富集和進一步分析檢測。利用UPLC-Q-TOF-MS法分析總倍半萜苷，發(fā)現(xiàn)在 “2.2.1”項條件下的混合物得到較好分離，其UPLC圖及對應(yīng)的總離子流色譜圖見圖2。通過與對照品Ⅰ、Ⅱ的紫外吸收光譜進行比對，并結(jié)合相對分子質(zhì)量信息 （表1），可初步推斷所得的總倍半萜苷中含有5個倍半萜苷類化合物（峰1～峰5），其余峰吸收相對較大，結(jié)合紫外吸收、高分辨率質(zhì)譜和碎片離子，推斷它們?yōu)榉潜栋胼栖疹惓煞?，值得進一步研究。

圖2 總倍半萜苷的色譜圖Fig.2 Chromatogram s of the m ixture of total sesquiterpene glycosides

2.4 質(zhì)譜分析

2.4.1 一級質(zhì)譜分析 以0.1%甲酸溶液為流動相，在負離子模式全掃描質(zhì)譜圖中，峰1～峰5均產(chǎn)生［M-H］-準分子離子峰和［M+HCOO］-加合離子峰，幾乎沒有碎片離子，故易于確定化合物的相對分子質(zhì)量。其中，峰1和峰4為同分異構(gòu)體，均產(chǎn)生［M-H］-離子（m/z 821.53）和［M+ HCOO］-離子 （m/z 867.54）；峰3和峰5為同分異構(gòu)體，均產(chǎn)生 ［M-H］-離子 （m/z 675.46）和［M+HCOO］-離子（m/z721.47）；峰2產(chǎn)生［MH］-離子（m/z 807.517 4）和［M+HCOO］-離子（m/z853.526 4）。

2.4.2 二級質(zhì)譜分析 為進一步確定峰1～峰5所對應(yīng)化合物的結(jié)構(gòu)，通過質(zhì)譜的碰撞誘導(dǎo)解離（CID）實驗，獲得二級質(zhì)譜信息 （表1，碎片離子采用Costello命名法［15］）。由于倍半萜苷化合物具有基本骨架相同和結(jié)構(gòu)相似的特點，故比較其結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜信息時發(fā)現(xiàn)，它們在軟電離狀態(tài)下均產(chǎn)生一系列糖苷鍵斷裂的碎片離子 （以下研究中，m/z值用整數(shù)表示）。

對峰1和峰4的準分子離子［M-H］-（m/z 821）進行二級質(zhì)譜研究，發(fā)現(xiàn)兩者均產(chǎn)生碎片離子m/z675、529、383、291、205。由此可知，m/z675離子為母離子［M-H］-失去Rha殘基（146 u）產(chǎn)生的碎片，即Rha為末端取代糖；進一步丟失1個Rha殘基 （146 u）產(chǎn)生離子m/z 529和383，說明有3個Rha取代；繼續(xù)丟失1個Glc-O殘基（162 u+ 16 u），生成苷元碎片離子m/z205，表明Glc直接與苷元相連。另外，m/z 291離子顯示有兩個Rha直接相連（Rha-Rha）。綜上所述，峰1和峰4均有3個Rha和1個Glc取代，糖體連接順序如下。

表1 枇杷葉倍半萜苷的質(zhì)譜數(shù)據(jù)Tab.1 M ass spectrometry data of sesquiterpene glycosides from the leaves of Eriobotrya japonica

與對照品比較發(fā)現(xiàn)，峰1的保留時間和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與對照品Ⅰ完全一致，因此確定峰1即為化合物Ⅰ。同時，結(jié)合文獻 ［4］可知，峰4與已知化合物loquatifolin A的分子質(zhì)量和糖鏈結(jié)構(gòu)一致，故推斷峰4可能為6，7-trans-nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→4）-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-［α-L-rhamnopyranosyl-（1→6）］-β-D-glucopyranoside，與化合物Ⅰ僅在苷元C-6和C-7位上的構(gòu)型有差異。

選擇峰3和峰5的［M+HCOO］-離子（m/z 721）進行二級質(zhì)譜研究，發(fā)現(xiàn)兩者均產(chǎn)生碎片離子m/z675、529、383、205，與峰1和峰4基本相同，推斷其裂解途徑一致。經(jīng)分析可知，m/z 675離子為母離子［M+HCOO］-丟失甲酸根產(chǎn)生的準分子離子［M-H］-；母離子丟失HCOOH和Rha殘基 （46 u+146 u），產(chǎn)生碎片離子m/z529，表明Rha為末端取代糖；進一步丟失1個Rha殘基（146 u），產(chǎn)生離子m/z383，說明只有2個Rha取代；繼續(xù)丟失1個Glc-O殘基 （162 u+16 u），產(chǎn)生m/z 205碎片離子，即為苷元的特征碎片離子，同時也顯示Glc直接與苷元相連。另外，m/z 291離子只出現(xiàn)在峰3的二級圖譜中，說明兩個Rha直接相連（Rha-Rha）。綜上所述，峰3和峰5均有2個Rha和1個Glc取代，但糖體連接順序不同，如下所示。

將峰3和峰5的保留時間和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)與對照品比較，發(fā)現(xiàn)峰3與對照品Ⅱ完全一致，因此確定峰3即為化合物Ⅱ。同時，結(jié)合文獻 ［5］可知，峰5可能為nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-［α-L-rhamnopyranosyl-（1→6）］-β-D-glucopyranoside。值得注意的是，先前報道的該成分為化合物Ⅰ的水解產(chǎn)物，而本實驗表明，它在枇杷葉中也天然存在，其一級和二級質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 峰5的一級 (a)和二級圖譜 (b)Fig.3 ESI-M S spectra(a)and ESI-MS/MS spectra (b)of the peak 5

對峰2的準分子離子［M-H］-（m/z 807）進行二級質(zhì)譜研究，發(fā)現(xiàn)亦產(chǎn)生碎片離子m/z 675、 529、383、205，說明與峰1和峰4存在相同的裂解途徑。經(jīng)分析考證，m/z675離子為母離子 ［MH］-失去一個五碳糖殘基 （pentose，132 u）產(chǎn)生的碎片，即為末端取代糖；進一步丟失1個Rha殘基（146 u），產(chǎn)生離子m/z 529和m/z 383，說明有2個Rha取代；繼續(xù)丟失1個Glc-O殘基（162 u+16 u），產(chǎn)生苷元的特征碎片離子m/z205，表明Glc直接與苷元相連。另外，m/z 277離子說明末端五碳糖與1個Rha直接相連。綜上所述，峰2有1個五碳糖、2個Rha和1個Glc取代，糖體連接順序如下。

目前，枇杷葉橙花叔醇型倍半萜苷中尚未報道有五碳糖取代基存在，因此推測峰2可能為新化合物，值得進一步分離和鑒定，其一級和二級質(zhì)譜圖見圖4。

3 結(jié)論

本實驗利用UPLC-Q-TOF-MS分析技術(shù)對所得枇杷葉總倍半萜苷進行定性分析，同時鑒定出5個倍半萜苷類化合物成分，并發(fā)現(xiàn)了1個新倍半萜苷和1個新天然產(chǎn)物，這為進一步開發(fā)利用相關(guān)化合物提供了研究基礎(chǔ)。從二級質(zhì)譜圖來看，這5個倍半萜苷類成分裂解途徑相似，均為逐個脫去寡糖鏈上的糖基，最后生成m/z205的特征苷元碎片。這些碎片特征和裂解規(guī)律也將為結(jié)構(gòu)相似的該類化合物苷元及糖鏈的結(jié)構(gòu)解析提供重要依據(jù)。

圖4 峰2的一級 (a)和二級圖譜 (b)Fig.4 ESI-MS spectra(a)and ESI-MS/ MS spectra(b)of the peak 2

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Analysis of sesquiterpene glycosides from loquat leaves by UPLC-Q-TOF-MS

ZHAO Lei， CHEN Jian， YIN Min， REN Bing-ru*， LIWei-lin
（Institute of Botany，Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences；Jiangsu Provincial Service Center for Anti-diabetic Drugs Screening，Nanjing 210014，China）

AIMTo analyze chemical constituents and fragmentation pathways of sesquiterpene glycosides isolated from loquat（Friobotrya japonica）leaves by ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS）.METHODSAlcohol extract of loquat leafwas subjected to a variety of column chromatographies，then UPLC was performed on Agilent ZORBAX SB-C18column with methyl alcohol-0.1%formic acid in water asmobile phase in a gradient elution mode.Themass spectrometer equipped with electrospray ionization source was used as a detector under the negative ionmode.RESULTS5 sesquiterpene glycosides had similar fragmentation pathways.The cleavage was presented in consecutive lose in monosaccharide residue of oligosaccharide chain to give specific product ions at m/z675，529，383，finally yielding a signature aglycone ion at m/z205.CONCLUSIONThese characteristic fragmentationsmay be loquatifolin A and 6，7-cis-nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→4）-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-［α-L-rhamnopyranosyl-（1→6）］-β-D-glucopyranoside，which exist the difference only at6，7-C configuration.

loquat（Friobotrya japonica）leaves；sesquiterpene glycosides；UPLC-Q-TOF-MS；loquatifolin A；6，7-cis-nerolidol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→4）-α-L-rhamnopyranosyl-（1→2）-［α-L-rhamnopyranosyl-（1→6）］-β-D-glucopyranoside

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-0000-00

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.022

2014-08-22

國家自然科學(xué)基金項目 （21102058）；江蘇省自然科學(xué)基金項目 （BK20141387）；江蘇省科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)計劃—科技公共服務(wù)平臺項目 （BM2011117）

趙 磊（1989—），男，碩士，從事天然藥物化學(xué)研究。E-mail：zhaoleilearning@126.com

*通信作者：任冰如 （1964—），女，研究員，從事經(jīng)濟和藥用植物資源的評價和開發(fā)利用。E-mail：bingruren@126.com