劉桂花， 邢建國， 王云飛， 帕依曼·亥米提， 何承輝

（新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊830004）

HPLC法同時測定復方必清顆粒中秋水仙堿、槲皮素及薯蕷皂苷元

劉桂花， 邢建國， 王云飛， 帕依曼·亥米提， 何承輝*

（新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆烏魯木齊830004）

目的建立同時測定復方必清顆粒 （菝葜、天山堇菜、秋水仙、訶子肉、白花丹、西青果、玫瑰花）中秋水仙堿，槲皮素及薯蕷皂苷元3種成分的HPLC法。方法復方必清顆粒80%甲醇提取液的HPLC分析在Cosmosil-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱進行，流動相為乙腈 （A）-0.4%磷酸 （B），梯度洗脫，秋水仙堿和槲皮素檢測波長為350 nm，薯蕷皂苷元為203 nm，體積流量1 mL/min，柱溫為35℃。結果秋水仙堿在7.62～76.2μg/m L、槲皮素在11.02～77.14μg/mL、薯蕷皂苷元在23.15～231.5μg/mL范圍內(nèi)均呈良好線性關系；相關系數(shù)分別為0.999 7，0.999 7，0.999 8；秋水仙堿、槲皮素及薯蕷皂苷元的平均回收率分別為99.8% （RSD為1.2%），100.0% （RSD為1.1%）和99.6% （RSD為1.1%）。樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。結論該方法中秋水仙堿和槲皮素的分離效果較好，峰形對稱，出峰時間適中，可作為該顆粒制劑的質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜法；復方必清顆粒；秋水仙堿；槲皮素；薯蕷皂苷元

復方必清顆粒處方來源于新疆維吾爾族醫(yī)院，是由菝葜、秋水仙、天山堇菜、訶子肉、地錦草、白花丹、西青果和玫瑰花八味藥材組成的復方制劑，為維藥經(jīng)典方，具有清血、消炎止痛的功效。用于子宮內(nèi)膜炎，宮頸糜爛，附件炎等婦科疾病。菝葜是方中君藥，近年來，以菝葜為主藥研制了多種復方治療婦科病，臨床常用于治療各種婦科炎癥，療效顯著?，F(xiàn)代藥理學研究表明：菝葜的總皂苷部位，具有明顯的抗炎效果，并且對細菌生長具有明顯的抑制作用。菝葜乙醇提取物具有抑菌作用，具有拮抗大鼠蛋白清性及角叉菜膠性動物足趾腫脹，以及對二甲苯所致大鼠耳腫脹有明顯的抑制鎮(zhèn)痛作用。菝葜中含有多種皂苷，其中薯蕷皂苷元（diosgenin）為其主要有效成分。秋水仙主要有效成分為秋水仙堿（colchicine），具有解毒散結、抗炎、消腫止痛的功效，是抗炎鎮(zhèn)痛抗風濕的主要活性成分。地錦草具有清熱解毒、利濕退黃、涼血止血的功效，藥理研究證實其化學成分中的槲皮素（quercetin）、山柰素等黃酮類化合物是地錦草抗菌、止血、抗氧化的主要有效成分。本實驗研究建立了高效液相色譜法同時測定復方必清顆粒中秋水仙堿、槲皮素和薯蕷皂苷元的量，旨在為及時檢測并全面跟蹤有效成分在復方必清顆粒制備過程中各工序的轉(zhuǎn)移率提供一種高效方法，同時也為該制劑的質(zhì)量評價提供科學的理論依據(jù)［1-9］。

1 儀器與材料

LC-20A型高效液相色譜儀 （日本島津制造）：SPD-20A紫外檢測器、LC-20AB溶劑輸送泵、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、LC-Solution數(shù)據(jù)工作站，AB135-S梅特勒-托利多電子天平 （瑞士），BS110S型Sartorius電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；JM-B2003電子天平 （余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司）；WP-UP-IV-10型Water Purifier實驗室專用超純水機（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；KDM型調(diào)溫電熱套（山東省鄆城永興儀器廠）。

對照品槲皮素 （批號100081-200907）、薯蕷皂苷元 （批號111539-200001）購自中國食品藥品檢定研究院，秋水仙堿對照品 （批號086K1576）購自美國Sigma-Aldrich（西格瑪）公司。復方必清顆粒由新疆醫(yī)科大學藥學院自制 （批號：130809、130813、130818）。乙腈購自美國霍尼韋爾（Honeywell B&J）公司，色譜純；甲醇購自天津市福晨化學試劑廠，分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件 Cosmosil-C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5μm），流動相為乙腈（A）-0.4%磷酸（B），按表1進行梯度洗脫；雙波長檢測，350 nm檢測秋水仙堿和槲皮素，203 nm檢測薯蕷皂苷元；體積流量1 mL/min；柱溫為35℃；進樣量10μL。運行時間為80 min。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取秋水仙堿對照品7.62 mg置25 m L量瓶中，槲皮素對照品5.71 mg、薯蕷皂苷元對照品4.63 mg分別置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL分別含秋水仙堿304.8 μg、槲皮素551μg和薯蕷皂苷元463μg的貯備液。分別精密吸取上述貯備液1.5、1.0、2.5 mL置10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成質(zhì)量濃度為45.72、55.1、115.75μg/mL的混合對照品溶液。將上述對照品貯備液、混合對照品溶液于4℃保存，備用。

2.2.2 供試品溶液 取復方必清顆粒樣品適量研細，約1.5 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入80%甲醇適量，超聲 （功率100 W，頻率40 kHz）處理45 min，取出，放冷，用80%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按復方必清顆粒的處方，分別稱取不含秋水仙、不含菝葜、不含地錦草的復方藥材，按 “2.2.2”項下的方法制成相應的陰性樣品溶液，4℃冷藏備用。

3 結果

3.1 專屬性試驗 分別精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液及陰性樣品溶液各10μL，按 “2.1”項下色譜條件進樣，結果，秋水仙堿、槲皮素和薯蕷皂苷元的保留時間分別為22、32、71 min左右，陰性樣品對測定沒有干擾，分離度良好，對照品、供試品及陰性樣品色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chrom atogram s

3.2 線性關系的考察 精密吸取秋水仙堿貯備液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對照品溶液。精密吸取對照品溶液10μL，注入色譜儀中，按 “2.1”項下色譜條件進行測定，以對照品質(zhì)量濃度X與其峰面積Y進行線性回歸，得秋水仙堿標準曲線，結果表明秋水仙堿在相應的線性范圍內(nèi)線性關系良好，見表2。

精密吸取槲皮素貯備液5mL至25mL量瓶內(nèi)，加甲醇至刻度，制成質(zhì)量濃度為110.2μg/m L的稀釋液。再精密吸取稀釋液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL分別置5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對照品溶液。精密吸取對照品溶液10μL，注入色譜儀中，按 “2.1”項下色譜條件進行測定，以對照品質(zhì)量濃度與其峰面積Y進行線性回歸，得槲皮素標準曲線，結果表明槲皮素在相應的線性范圍內(nèi)線性關系良好，見表2。

精密吸取薯蕷皂苷元貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置10 m L棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列對照品溶液。精密吸取各對照品溶液10μL，注入色譜儀中，按 “2.1”項下色譜條件進行測定，以對照品質(zhì)量濃度X與其峰面積Y進行線性回歸，得薯蕷皂苷元標準曲線，結果表明薯蕷皂苷元在相應的線性范圍內(nèi)線性關系良好，見表2。

表2 回歸方程及線性范圍Tab.2 Regression equations and linear range of reference substances

3.3 精密度試驗 取混合對照品溶液，按上述“2.1”項下色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，秋水仙堿、槲皮素和薯蕷皂苷元峰面積的RSD（n=6）分別為1.2%、0.9%、1.5%。結果表明儀器精密度良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批號 （批號130809）樣品，按 “2.2.2”項下方法制備一份供試品溶液，室溫放置，按 “2.1”項下色譜條件分別在0、2、6、12、24 h進行測定，測得供試品溶液中秋水仙堿、槲皮素及薯蕷皂苷元峰面積的RSD（n=6）分別為1.0%、1.2%、1.4%。結果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 重復性試驗 取批號130801的樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，按上述色譜條件測定。計算求得秋水仙堿、槲皮素及薯蕷皂苷元的平均含有量 （n=6）分別為0.273 8、0.592 8、0.983 9 mg/g，RSD分別為1.5%、1.9%、1.6%，表明該方法重復性良好。

3.6 加樣回收率試驗 精密稱取0.75 g已知含有量的復方必清顆粒樣品 （批號130809），共9份，平均分為3組，分別按樣品中各成分含有量與相應對照品加入量的比例約為1∶0.8、1∶1、1∶1.2，精密加入秋水仙堿對照品溶液（0.304 8 mg/mL）0.5、0.7、0.9mL，槲皮素對照品溶液 （0.181 2 mg/mL）2.0、2.5、3.0 mL，薯蕷皂苷元對照品溶液（0.297 6 mg/mL）2.0、2.5、3.0 mL，按“2.2.2”項下方法制備溶液，按 “2.1”項下色譜條件測定，并計算加樣回收率。結果見表3。

表3 加樣回收率試驗的結果Tab.3 Results of recovery tests

3.7 樣品測定 取3個批號的復方必清顆粒樣品（批號分別為130809、130813、130818），各3份，按 “2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定3批樣品中秋水仙堿、槲皮素及薯蕷皂苷元的量，結果見表4。

表4 樣品測定結果(mg·g-1,n=3)Tab.4 Test results of sam p les(mg·g-1,n=3)

4 討論

4.1 檢測波長的選擇 據(jù)文獻報道，槲皮素的檢測波長為360 nm［10］、368 nm［11］、254 nm［12］。本實驗于200～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)秋水仙堿在350 nm和245 nm處有最大吸收，當選擇254 nm時，樣品中秋水仙堿峰的前面有個小峰的干擾，因樣品中秋水仙堿的峰面積比槲皮素的峰面積小，為減少干擾，提高方法的準確度，故考慮采用秋水仙堿的紫外最大吸收波長350 nm作為檢測波長。且在此波長下，秋水仙堿和槲皮素的分離效果都很好。查閱文獻可知［13］，薯蕷皂苷元的最大吸收波長為203 nm。此條件也符合 《中國藥典》2005年版菝葜項下測定薯蕷皂苷元的條件。

4.2 梯度洗脫依據(jù) 根據(jù)文獻報道［13-15］，秋水仙堿和槲皮素多采用甲醇-0.4%磷酸 （50∶50）為流動相，出峰時間均小于30 min，但薯蕷皂苷元在此條件下出峰很晚，在90 min時還未出峰，《中國藥典》2005年版菝葜項下測定薯蕷皂苷元的條件為乙腈-水 （90∶10），因此，選擇梯度洗脫。本實驗嘗試了乙腈-水、乙腈-0.4%磷酸系統(tǒng)，結果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水為流動相時，秋水仙堿和槲皮素峰的拖尾都較嚴重，分離效果差。采用乙腈-0.4%磷酸系統(tǒng)，在梯度的前段，當采用乙腈-0.4%磷酸（25∶75）時，秋水仙堿和槲皮素的分離效果較好，峰形對稱，出峰時間適中。在梯度的后段，當選擇乙腈-0.4%磷酸 （90∶10）時，薯蕷皂苷元的出峰時間為71 min，分離效果較好。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2005年版一部［S］.北京：化學工業(yè)出版社，2005：216.

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Simultaneous determ ination of colchicine，quercetin and diosgenin in Com pound Biqing Granules by HPLC

LIU Gui-hua， XING Jian-guo， WANG Yun-fei， Payiman-Haimiti， HE Cheng-hui*
（Xinjiang Instituteof Meteria Medica，Urumchi830004，China）

AIMTo establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of colchicine，quercetin and diosgenin in Compound Biqing Granules（Smilax，Viola tianshanica Maxim，Colchicum autumnale，F(xiàn)uphorbia humifusa，Terminalia chebula，etc.）.METHODSHPLC analysis of 80%methanolic extract from Compound Biqing Granules was performed on Cosmosil column（250 mm×4.6 mm，5μm）.The mobile phase consisted of acetonitrile（A）-0.4%ortho-phosphoric acid（B）solution in a gradientelutionmode，the detection wavelength was set at 350 nm for colchicine and quercetin as well as 203 nm for diosgenin and flow rate was 1 mL/min.The column temperature wasmaintained at35℃.RESULTSThemethod had good linear relationship within the range of 7.62-76.2μg/mL for colchicine（r=0.999 7），11.02-77.14μg/mL for quercetin（r= 0.999 7），and 23.15-231.5μg/mL for diosgenin（r=0.999 8），respectively.The average recoveries were 99.8%（RSD=1.2%）for colchicine，100.0%（RSD=1.1%）for quercetin，99.6%（RSD=1.1%）for diosgenin，respectively.The sample solution was stable within 24 h.CONCLUSIONThemethod has a good separation effects，symmetrical peak forms，and peak flowing out available，and is recommended as control standard for Compound Biqing Granules.

HPLC；Compound Biqing Granules；colchicine；quercetin；diosgenin

R927.2

：A

：1001-1528（2015）07-1487-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.020

2014-10-09

新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項 （201130105-3）

劉桂花 （1984—），女，助理研究員，碩士，從事藥物新制劑與新劑型研究。Tel：（0991）2318172，E-mail：lisena_lgh@ 163.com

*通信作者：何承輝 （1974—），女，副研究員，碩士，從事藥物新制劑與新劑型研究。Tel：（0991）2318172，E-mail：hch301@sohu.com